α—硫辛酸上调HO—1表达发挥对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用

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摘 要 ：目的：探讨α-硫辛酸（α-lipoic acid,ALA）对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用的分子机制.方法：将大鼠随机分为5组：正常组、模型组、ALA干预组、氯血红素（Hm）组以及锌原卟啉（ZnPP）组.给药后进行肺组织的形态学观察,并测定丙二醛（MDA）的含量以及血红素氧合酶-1（hemeoxygenase,HO-1）的活性；RT-PCR检测HO-1 mRNA和蛋白的表达情况.结果：采用手术方法成功复制出脓毒症急性急性肺损伤模型,同时,肺组织中MDA含量、HO-1蛋白活性、HO-1 mRNA水平均高于阴性对照组（P均<0.05）；ALA和Hm干预组肺组织损伤程度、MDA含量低于模型组.而HO-1抑制剂ZnPP处理后肺损伤程度、MDA含量高于LPS组（P<0.05）.结论：ALA对脓毒症急性肺损伤的保护作用可能通过增强HO-1活性、上调mRNA表达水平而实现的.

关 键 词 ：脓毒症急性肺损伤；ALA；血红素氧合酶

脓毒症（sepsis）是由感染所引发的全身炎症反应综合征,是ICU入住患者的首位死因.目前认为ALI本质是一种肺内过度性、失控性的炎症反应,中性粒细胞于肺内大量聚集是ALI的基本病理特征.因此,针对促炎/抗炎反应失衡的方向和程度,采取不同的干预措施,恢复双方动态平衡是防治ALI的关键.α-硫辛酸（α-lipoic acid,ALA）是一种硫氰化合物,天然存在于人类日常饮食的食物、动物组织以及植物中.研究显示,ALA可抑制巨噬细胞/Kupffer细胞促炎症细胞因子、NO以及ROS的产生而发挥抗氧化和抗炎症活性[1].本研究旨在探讨ALA对脓毒症诱导的ALI中发挥保护作用的分子机制.

1材料和方法

脓毒症急性肺损伤大鼠模型的构建及分组

雄性SPF级SD大鼠（体重200g～250g）购自南华大学实验动物中心.动物随机分为5组：①对照组（或假手术组）：SD大鼠用10%水合氯醛生理盐水麻醉（400mg/kg）,沿前腹正中线作3cm长的切口,取出盲肠,然后逐层关腹.②模型组：取出盲肠后,用4.0丝线在距盲端1. 5cm处结扎,用18号针头在盲肠结扎处远端队穿刺2次,挤出少量粪便,随后将盲肠回纳入腹腔中,逐层关腹.③～⑤CPC干预组：术后2h分别予20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg CPC（Sigma-Aldrich）腹腔注射,12h后给予第二次注射.72h后处死大鼠用于下一步研究.

肺组织MDA的测定

大鼠安乐死后,取各组右肺下部,获得湿重,然后在烤箱内60℃放置48h,获取干重.计算肺湿/干比值.MDA含量的测定按试剂盒提供的步骤分别加入测试样品及试剂,混匀后95℃水浴40min,4000r/min离心10min,测定上清中OD值（波长532nm）,结果以nmol/ml表示.

肺组织HO-1活性检测

取肺组织加入5体积冷蔗糖Tris﹒HCl缓冲液（pH 7.4）制备组织匀浆,4℃ 13 500 g离心20 min,弃沉淀；上清液15 000 g离心60 min.所获得的微粒体悬浮于100 mmol/L磷酸钾缓冲液（含0.1 mmol/L EDTA,pH 7.4）中,制成微粒体悬液,用考马斯亮兰法测蛋白含量.HO-1的活性测定按参考文献提供的方法进行[2].

RT-PCR检测HO-1 mRNA的表达

用Trizol试剂从处理的细胞中提取细胞总RNA,使用AMV逆转录酶和随机9聚体合成第一链cDNA.HO-1和β-actin（内对照）的引物为：HO-1（309bp）：5’-CTTTCAGAAGGGTCAGGTGTCCA-3’（上游）和5’-CTGAGAGGTCACCCAGG TAGCGG-3’（下游）.β-actin（224bp）：5’-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3’（下游）.PCR反应结束后取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、拍照.

1.1统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件处理数据.计量资料用 ±S表示,组间比较采用one-way ANOVA分析后行Student-Newmen-Kuels q检验.P<0.05表示统计学差异有统计学意义.

2结果

1.1肺组织MDA含量的变化

模型组肺组织中MDA含量高于对照组（P<0.05）,两者分别为（11.63±2.71）μmol/ml和（68.37±1.98）μmol/ml.ALA处理后,MDA含量降至（24.18±5.37）μmol/ml （P<0.05）：Hm处理组MDA水平也低于模型组,但ZnPP组MDA含量进一步增高.

1.2肺组织中HO-1活性改变情况

药物处理6 h和12 h后,模型组肺组织中HO-1的活性显著高于相应对照组（P<0.05）；ALA干预组和Hm组HO-1活性进一步增高,分别达（782.45±33.41）nmol/（mg protein·h）和（869.71±64.72）nmol/（mg protein·h） .ZnPP处理后HO-1活性低于模型组（P<0.05）.

1.3HO-1 mRNA表达

RT-PCR结果显示,ALA干预组中HO-1基因mRNA表达水平明显高于模型组,灰度值为（0.67±0.08）VS（0.44±0.05）,P<0.05,但略低于Hm处理组.而ZnPP组与对照组相比无明显差异.

2.讨论

脓毒症是ICU患者死亡的首位死因.在疾病的发生过程中,肺是最先被累及的器官.本研究采用经典的大鼠盲肠结扎穿刺法建立了脓毒症肺损伤动物模型[3].MDA是氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化所形成的产物,其含量变化可反映组织氧化损伤的程度,机体清除自由基的能力[4].本实验结果表明LPS引起肺组织匀浆上清MDA含量增高,提示ALI发病过程中有自由基的增多.同时也发现,HO-1的活性显著增高,这表明脓毒症肺损伤发生时,肺组织表达上调的HO-1可能机体抵御损伤的一种自我保护机制.目前,上调HO-1表达主要有基因转染和药物诱导两类方法,但均因安全性以及副作用等问题均无法达到理想的效果.因此寻求安全、高效的HO-1的天然诱导剂具有非常重要的实用意义.为此我们采取了ALA作为研究对象,主要基于能通过影响多种信号系统,直接和间接的发挥抗氧化和免疫调控,从而发挥对机体细胞保护的作用.结果证实,ALA处理后,与模型比较,肺组织内MDA下降,组织HO-1活性增强,同时HO-1 mRNA表达进一步上调.同时采用HO-1特异性抑制剂ZnPP,能明显逆转其上述效应.这表明上调HO-1的表达是ALA抗炎的重要机制之一.事实上,脓毒症肺损伤起病急骤,发病持续,临床上通常在其发病后才采取相应治疗措施.本实验在设计时充分考虑了这一点,尽量模拟临床实际来观察ALA在脓毒症肺损伤发生后的治疗效果.本实验结果表明,在发病初始阶段,及时给予ALA,可有效减轻肺部的炎症反应,减轻肺损伤,有很好的临床应用价值.