本站原创这是一篇关于引物类专升本毕业论文范文,与药用植物草珊瑚AFLP反应体系的建立相关毕业论文开题报告范文。是论文模板专业与引物及基因组及体系方面相关的免费优秀学术论文范文资料，可作为引物方面的大学硕士与本科毕业论文开题报告范文和职称论文论文写作参考文献下载。
摘 要 ：从草珊瑚（Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ）的幼嫩叶片中提取基因组ＤＮＡ,建立草珊瑚ＡＦＬＰ反应体系,对ＡＦＬＰ反应体系中模板ＤＮＡ的浓度、基因组ＤＮＡ的双酶切时间、预扩增产物的稀释倍数和引物组合的筛选等关键因素进行摸索.优化的草珊瑚ＡＦＬＰ反应体系为模板ＤＮＡ的用量２０ ｎｇ／μＬ、酶切反应时间４ ｈ、预扩增产物稀释１５倍,初步筛选出８对较为适合草珊瑚ＡＦＬＰ分析的引物组合.
关 键 词 ：草珊瑚（Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ）；ＡＦＬＰ反应体系；建立
中图分类号：Ｓ５６７．２３＋９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）17－3879-03
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＡＦＬＰ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ
ＴＡＮＧ Ｍｅｉ－ｑｉｏｎｇ,ＹＡＯ Ｓｈａｏ－ｃｈａｎｇ,ＬＩ Ｌｉｎ－ｘｕａｎ,ＬＡＮ Ｚｕ－ｚａｉ,ＬＩＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ｚｈｕ
（Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔ／Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ,
Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２３, Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＡＦＬＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ of ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ, ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ, ｄｉｌｕｔｉｎｇ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ, ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＡＦＬＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓ． ｇｌａｂｒａ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ, ｄｏｓａｇｅ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ, ２０ ｎｇ／μＬ； ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｔｉｍｅ, ４ ｈ； preamplification product diluted 15 times. ８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ＡＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓ． ｇｌａｂｒａ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ； ＡＦＬＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ
草珊瑚（Ｓａｒｃａｎｄｒａ ｇｌａｂｒａ）又名肿节风、九节茶,是金粟兰科（Ｃｈｌｏｒａｎｔｈａｃｅａｅ）草珊瑚属植物,其全株具有祛风通络、活血散瘀、接骨续筋等功效,民间常用来治疗跌打损伤、关节风湿等疾病［１］.近年来对草珊瑚的研究发现其成分多样,具有多种药理作用,如抗菌、抗病毒、抗肿瘤等［２］,现已开发出多种产品（草珊瑚片、草珊瑚注射液、草珊瑚浸膏、草珊瑚含片等）.草珊瑚分布广泛,各产地品种混杂,质量参差不齐.因此有必要运用分子遗传标记技术对草珊瑚野生资源进行分类、质量分析、良种选育研究.目前,尽管ＩＳＳＲ［３］、ＲＡＰＤ［４］反应体系已经在草珊瑚上成功建立,但存在反应体系扩增条带少、易受到反应条件变化及材料来源不同的影响等问题.
ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）是一种十分有效的分子标记技术［５］,其不需要预先知道基因组的序列特征,检出的多态位点能覆盖整个基因组,具有稳定可靠、重复性强、灵敏度高等特点,而且操作程序易于标准化［６］,已被广泛应用于植物研究中［７－１０］.本研究拟建立一套适合草珊瑚的ＡＦＬＰ反应体系,以期为草珊瑚种质资源地理变异分析及良种选育工作提供参考.
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
实验材料为广西不同产地采集的１８份野生草珊瑚种质资源,取其鲜嫩叶片用硅胶干燥保存.
限制性内切酶ＭｓｅⅠ和ＥｃｏＲⅠ购自ＭＢＩ公司,Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ购自天根生化科技（北京）有限公司,ＭｓｅⅠ／ＥｃｏＲⅠ连接接头和引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成,亲和硅烷和剥离硅烷购自北京鼎国生物技术有限责任公司,其余试剂均为国产分析纯.电泳仪、ＰＣＲ仪、凝胶成像系统购自美国伯乐公司,大型垂直电泳系统购自北京市六一仪器厂,离心机购自德国Ｓｉｇｍａ公司.
１．２ 实验方法
１．２．１ 基因组ＤＮＡ的提取与检测 采用改良的ＣＴＡＢ法提取草珊瑚叶片基因组ＤＮＡ［１１］,用０．８％的琼脂糖凝胶电泳检测所提取ＤＮＡ的纯度和完整性,根据标准的λＤＮＡ浓度将提取的草珊瑚基因组ＤＮＡ统一稀释为５０ ｎｇ／μＬ.
１．２．２ 草珊瑚ＡＦＬＰ体系的建立 ＡＦＬＰ实验按照Ｖｏｓ等［５］的方法进行,并对模板ＤＮＡ用量、酶切时间、预扩增产物稀释倍数等条件进行优化.①基因组ＤＮＡ的双酶切.分别取１００、２００、３００、４００、５００ ｎｇ草珊瑚基因组ＤＮＡ,加入４ Ｕ ＭｓｅⅠ和１０ Ｕ ＥｃｏＲⅠ进行双酶切,总反应体系为２０ μＬ,酶切时间分别为２、３、４、５ ｈ.②接头连接.取酶切后的ＤＮＡ样品,加入ＭｓｅⅠ／ＥｃｏＲⅠ接头及１ Ｕ Ｔ４ ＤＮＡ连接酶于１６ ℃下连接３ ｈ.③预扩增反应.取３ μＬ稀释１０倍后的连接产物作为扩增模板进行ＰＣＲ扩增.④选择性扩增.分别取稀释５、１０、１５、２０倍的预扩增产物３ μＬ进行选择性扩增.⑤变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染.参考文献［１２］的方法进行.⑥选择性引物筛选.每个ＥｃｏＲⅠ引物分别与每个ＭｓｅⅠ引物进行组合,共有６４对引物组合,选出１０个具有代表性的草珊瑚ＤＮＡ样品用于ＡＦＬＰ分析中选择性扩增引物的筛选.选出多态性较好、分布均匀、电泳谱带清晰可辨的引物组合.