南美白对虾桃拉病毒和白斑病毒多重PCR检测体系的建立

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摘 要：养殖对虾可混合感染多种病毒,桃拉病毒（Taura syndrome virus, TSV）和白斑病毒（White spot syndrome virus, WSSV）是南美白对虾感染的主要病原体,建立TSV和WSSV的多重聚合酶链式反应 （PCR）技术可有效防制疫病的爆发.根据GenBank公布的TSV和WSSV全基因组序列,分别设计TSV和WSSV的特异性引物,并在四种不同的PCR系统中扩增筛选,在同一电泳道内得到与预期结果相符的、可明显区分的2条特异条带,PCR扩增产物测序显示分别与TSV和WSSV基因序列吻合,本体系的建立为生产鉴别和诊断混合感染病毒奠定基础.

关 键 词 ：南美白对虾；桃拉病毒；白斑病毒；多重PCR；检测

中图分类号：S188 文献标识码：A

我国沿海地区是南美白对虾养殖的主要产业区,在人工养殖环境中,对虾可同时感染几个病原体或病毒.优质的南美白对虾亲虾及虾苗主要从国外引进,同时也有可能将潜在的病毒带入境内.桃拉综合症病毒（Taura syndrome virus, TSV）和白斑症（White spot syndrome virus, WSSV）一直是对虾养殖中的主要病毒原,这两种病毒对对虾养殖一度造成严重的危害,并有混合感染引起大规模死亡的情况发生[1].

对虾TSV和WSSV的检验方法主要有肉眼外部症状观察、显微镜观察、组织病理学实验、抗体实验和聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）等方法[2,3].其中PCR被证明是检测对虾病毒感染高效、简单及快速的诊断工具.RT-PCR技术已应用于对虾WSSV和TSV病毒的检测,但一次PCR只能检测一种病原体样本[4,5].多重PCR是一种特殊PCR形式,其突出特点是一次PCR反应即可同时检测、鉴别出多种病原体,在临床诊断TSV和WSSV的混合感染具有很高的实用价值[6,7]；但是多重PCR检测方法受多种因素影响,如引物的特异性、模板的质量以及不同病毒样本PCR的扩增条件均能影响检测的灵敏度和准确性.本研究通过优化PCR扩增条件,建立了高效的南美白对虾TSV和WSSV多重PCR检测技术,这一检测体系具有很高的特异性和较高的灵敏性.

1.材料和方法

1.1 样品采集

疑似TSV和WSSV感染对虾在绍兴地区沿海岸线共5个对虾养殖基地进行对虾样品收集,对虾采集时在一个地点的不同池塘里捕捞对虾,然后随机抽取一定数量的样品,运至绍兴文理学院冻于-80℃冰箱中.

1.2 核酸提取

1.2.1白斑病毒DNA提取

取疑似WSSV发病对虾内脏组织共约0.1g,加入200μL裂解液（0.4M NaCl,10mM Tris-HCl, 2Mm EDTA, pH 8.0）研磨均匀后补加100μL,6000g 离心去杂质及细胞碎片,取上清液；在上清液中加入30μL 20%SDS和3μL 20mg/mL蛋白酶K混合均匀,在55℃温育1-2h；在反应液中加入苯酚,氯仿,异戊醇（25：24：1）去除残余蛋白,离心后取上清；加入等体积异丙醇混匀,-20℃沉淀30min,10000g在4℃离心10min,加75%乙醇沉淀；得到的DNA溶于20μL双蒸水中于-20℃备用.

1.2.2桃拉病毒RNA提取

按Invitrogen公司Trizon试剂盒操作方法提取发病对虾腹部及内脏部桃拉病毒RNA,按Promega公司试剂盒操作方法合成cDNA,1μLTSV模板分别加入PCR反应体系12.5l（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司）,以上各项步骤严格按照试剂盒操作.

1.3 引物的设计和合成

根据GenBank公布的WSSV和TSV全基因组序列,分别设计TSV和WSSV的2个特异性引物,引物由上海生工合成.WSSV PCR检测用的引物：5’ -TCACAGGCGTATTGTCTCTCCT -3’,5’ - CACGAG TCTACCGTCACAACATC -3’ TSV RT-PCR检测用的引物： 5'-GCTTGCGTGGTGGGACTTA-3' ,5'-TCAATGAGAGCTTGGTCCTGG-3'

1.4 PCR反应体系的建立和优化

1μLTSV和WSSV模板分别加入PCR反应体系12.5l（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司）,再分别加入TSV和WSSV引物正向及反向各0.5l,加重蒸馏水至终体积25μL.为筛选扩增条件,设计四种不同的反应体系：

1.4.1：95℃2min,94℃30S,68℃ 1 min,35个循环；68℃ 2 min,1个循环；

1.4.2：94℃1 min,1个循环；51℃min,72℃1min,94℃ 30S,35个循环；51℃： 1 min ,72℃ 5 min,1个循环；

1.4.3：94℃4min,50℃1min,72℃ 1 min,35个循环；72℃ 5 min,1个循环；

1.4.4：94℃5 min,1个循环；94℃45S,55℃45S,72℃ 1 min,35个循环；72℃10min,1个循环.

1.5 TSV和WSSV多重PCR实验

桃拉病毒1μL逆转录cDNA模板和白斑病毒1μLDNA模板,加入PCR反应体系25l（2×Taq PCR MasterMix,北京艾德莱生物科技有限公司）,加入桃拉病毒和白斑病毒引物正向及反向各0.5μL,加重蒸馏水至终体积50μL.另外设立阳性对照和的阴性对照.将反应管置于PCR仪上,根据1.4研究结果,按反应体系⑵进行扩增,具体如下94℃1 min,1个循环；51℃min,72℃1min,94℃ 30S,35个循环；51℃：1 min,72℃ 5 min,1个循环. 1.6 多重PCR的特异性及敏感性试验

TSV和WSSV核酸模板的样品与对虾其他病原核酸样品,分别加入到多重PCR反应体系中进行扩增,以检测其特异性.将抽提的WSSV DNA和TSV RNA作为模板分别测其含量后,将核酸作l0倍系列稀释,并对上述模板进行多重PCR扩增以检测其敏感性.

1.7 测序与序列分析

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳富集,按照试剂盒操作手册进行用胶回收试剂盒回收目的片段.将纯化后的PCR产物直接送至上海英俊公司（Invitrogen）测序.序列分析用DNASTAR 4.2（DNASTAR Inc.）和 Clustal X 1.83软件,分析结果经GeneDoc 2.6.000编辑.

2.结果

2.1 PCR条件的优化

TSV和WSSV核酸提取后,PCR反应体系中加入相应引物.通过对变性和退火温度时间和循环次数的控制,设计四种（1,2,3,4）不同的PCR反应体系.结果显示所有含有反应体系均能扩增出与实验设计大小相符的210bp（TSV）（图1）和300bp（WSSV）（图2）的两条特异条带.图中阿拉伯数字0,1,2,3,4,5分别代表DNA marker, 反应条件1,2,3,4以及阴性对照.图1,2结果显示TSV和WSSV PCR在反应体系2和4的条带最为清晰,但反应体系2用时较短.因此,TSV和WSSV最佳PCR反应条件为94℃1 min,1个循环；51℃min,72℃1min,94℃ 30S,35个循环；51℃： 1 min ,72℃ 5 min,1个循环.

2.2 特异性分析

TSV和WSSV核酸模板的样品与对虾其他病原核酸样品,结果含有WSSV和TSV核酸的样品能扩增出的相应特异条带,而非WSSV和TSV核酸的样品组未见任何条带（结果未显示）.将WSSV和TSV样品组扩增送检测序后,PCR产物的序列如图3（TSV PCR序列）和图4（WSSV PCR序列）所示,将该序列输入NCBI的BLAST搜索软件,结果证明序列长度分别为217bp和301bp,与TSV和WSSV的同源性为100%.

2.3 敏感性分析

将抽提的WSSV DNA和TSV RNA作为模板分别测其含量后,将核酸作不同倍数稀释,并对上述模板在反应体系2中进行PCR扩增,该体系最低能同时检测到约为5pg的WSSV和0.5 pg的TSV核酸模板.

2.4 多重PCR检测结果

采用WSSV的引物和TSV引物,经过多重PCR扩增,产物电泳后分别得到300bp大小（WSSV） （图5. 3, 6） 的和210bp（TSV） （图5. 4, 7）大小的电泳条带,与预期的结果一致；并且300bp的WSSV和210bp的TSV能在同一凝胶电泳中明显区分出来（图5. 5, 8）；而阴性对照1和9则没有条带出现,2为DNA marker.

3.讨论

对虾TSV和WSSV病毒是对虾养殖业中备受关注的病原,南美白对虾已成为浙江省水产养殖的主打品种.近年来,随着对虾虾苗和水产品国际贸易增加,这两种病毒的混合交叉感染较为普遍,因此对该病毒的进行检测与监控具有十分重要的意义.

对虾病病毒检测的方法包括组织学、原位杂交法,以及生物活性法,这些方法较为费时费工[8,9]；而且往往只能适用于发生急性感染的虾只,而病毒携带的对虾往往不出现应有的临床症状和病理反应,因此使用上述方法存在一定的局限性,加大了检测的难度.RT-PCR技术是一种简易有效的检测方法,但是传统的PCR方法一次只能检测一个样本[4,5].多重PCR是一种特殊的PCR方法,能在一个反应体系中加入多对引物,同时扩增多个目的片段.但是多重PCR检测方法受多种因素影响,如引物的特异性、模板的质量以及不同病毒样本PCR的扩增条件均能影响检测的灵敏度和准确性[10].本研究依据多重PCR设计原则,采用GenBank公布的WSSV和TSV全基因组序列,设计了两对特异引物分别扩增TSV和WSSV病毒.该两对引物扩增片段较小,PCR扩增片段分别为210bp（TSV）和300bp（WSSV）,且大小差异不大,同时又能在凝胶电泳中区分出来.事实上实验结果也符合引物设计的原则,在合适的反应条件下获得了较为理想的多重PCR扩增结果.即同时扩增出两个特异的WSSV和TSV条带,且能明显区分.

除引物设计外,筛选出适宜的PCR条件以满足两个片段的同时扩增也是多重PCR成功的关键因素.为此,本研究依据片段的长短及引物碱基的分布,设计出四种不同的PCR扩增条件.实验结果显示,虽然四个体系中均可扩增出目的片段,但是扩增效率及条带的分布存在差异,其中以94℃1 min,1个循环；51℃min,72℃1min,94℃ 30S,35个循环；51℃： 1 min ,72℃ 5 min,1个循环扩增条件最好,在该体系下各条带清晰,条带密集,且是四个体系中所用时间最短的一种.

TSV和WSSV核酸模板与对虾其他病原核酸样品进行扩增反应,结果含有WSSV和TSV核酸的样品能扩增出的相应特异条带,而非WSSV和TSV核酸的样品组未见任何条带.条带测序结果显示与TSV和WSSV的同源性为100%.这些研究结果表明该多重PCR具有良好的特异性.敏感性实验表明,该多重PCR最低能同时检测到5 pg的WSSV DNA和0.5pg的TSV RNA模板,检测出如此微量的病原DNA/RNA,说明该方法可用于病毒携带的无临床症状的对虾检测.本体系的建立为生产鉴别和诊断混合感染病毒奠定基础.