珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化

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摘 要 ： 以裸果木新鲜叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+ 、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等,建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系：模板DNA为4 ng/μL,引物浓度为0.3 μmol/L,dNTP浓度为0.5 mmol/L,Mg2 +浓度为2.0 mmol/L,Taq酶用量为1 U,ddH2O补足25 μL；94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,36 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环,最后72 ℃延伸10 min,扩增结果稳定.

关 键 词 ： 裸果木；RAPD；反应体系；优化

中图分类号： Q 78文献标识码： A文章编号： 10095500(2012)01000705

裸果木(Gymnocarpos przewalskii) 隶属石竹科（Caryophyllaceae）裸果木属(Gymnocarpos),主要分布在新疆南部山区、甘肃河西走廊、青海西部、内蒙古西部、宁夏东南部(沙坡头地区) \[1\].裸果木是古地中海荒漠残遗种,属于珍稀植物,为1987年我国首批公布的国家二级保护植物,1997年被定为一级保护植物.对研究我国西北和内蒙古荒漠的发生、发展、气候变化及旱生植物区系成分的起源有着非常重要的科学价值\[2\].近年来,由于生存环境的恶化,及自身生物学因素,又遭樵采和骆驼啃食等人类各种经济活动的干扰和破坏,裸果木的种群数量急剧减少,分布区已日益缩小和片段化\[3\].开展种群遗传学研究,制定相关的保护计划,是保护其的有效途径.

目前有关裸果木的相关研究主要集中在形态解剖学\[4,5\]、生理生态\[6-8\]、组织培养和扩繁\[9\]以及化学成分研究\[10\]等方面,有关分子水平的研究较少.随机扩增多态性DNA(RAPD)技术是以PCR为基础的一种分子标记,具有操作简便、快速、低成本、多态性检出率高等优点\[11\],在遗传多样性评价、物种分类与鉴定、遗传图谱构建等方面有广泛的应用\[12,13\],由于RAPD引物的随机性及较低的退火温度等导致的条件不稳定等,影响了该技术的应用.在应用该技术时,通常需要对其反应体系进行优化,以提高其稳定性.为此进行了裸果木RAPD体系的构建和优化试验,为开展裸果木种质资源保护和管理提供有价值的科学参考.

1材料和方法

1.1材料

自2008～2009年10月,采集了甘肃省肃北县红柳峡口子干沟一带裸果木叶片若干.

试剂 40个10 bp大小的RAPD随机引物、Taq酶、10×Taq缓冲液、Mg2+、dNTP均购自大连宝生物有限公司；琼脂糖、DNA Marker等均购自天为时代科技有限公司.

1.2方法

1.2.1裸果木DNA提取及浓度、纯度检测DNA提取按改良CTAB法进行\[14\].在紫外分光光度计上,检测DNA样品的浓度和纯度.

1.2.2RAPDPCR反应体系的建立及优化PCR 反应在PE480型DNA扩增仪中进行.参考一般反应体系\[15\],分别在25 μL反应体系中加入模板DNA、Mg2+、dNTP、Taq酶、引物和ddH2O.之后盖上盖子振荡混匀.设置94 ℃预变性5 min,30个循环进行94 ℃变性45 s,36 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃延伸10 min.

优化RAPD反应体系时,固定扩增程序,每次改变RAPD反应中的1个参数,以确定该参数对RAPD结果的影响.筛选的参数包括: (1)模板DNA质量浓度；(2) dNTPs浓度；(3)引物用量；(4) Mg2+浓度.同时对扩增程序中的退火温度和变性时间也进行优化,以找到合适的反应条件.

2结果与分析

2.1提取的模板DNA浓度和质量

对提取的裸果木基因组DNA 进行琼脂糖凝胶电泳.DNA条带明亮,无严重拖尾和降解现象,可见所提取的基因组DNA较完整,质量较高,能应用于RAPD反应分析(图1).与λDNA的浓度梯度进行比较,估测出DNA的浓度为100 ng/μL左右.经紫外分光光度计检测, D260mm /D280mm比值均在1.6～1.9.

图1DNA电泳检结果

Fig.1The DNA electrophoretic bands extracted from lees

2.2RAPD反应体系优化和程序确立

2.2.1反应体系优化结果（1）DNA模板浓度根据预实验设置了0.4、2.0、4.0、6.0、8.0 ng/μL 5个DNA模板浓度梯度.模板DNA用量为10 ng时,扩增条带暗淡；之后,随着模板DNA用量的增加（2.0～6.0 ng/μL）,条带逐渐清晰、明亮,当模板DNA用量4.0 ng/μL时,扩增效果最佳；其大于6.0 ng/μL时,条带数目逐渐减少.这表明模板DNA用量过少时,扩增产物太少且条带也暗淡(图2).模板DNA用量较大时,由于“平台效应”表现为条带数量逐渐减少.据此实验确定裸果木多态性研究的RAPD反应合适的DNA模板浓度为4.0 ng/μL(100 ng).

（2）Mg2+浓度设置了1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 5个Mg2 +浓度梯度,设计的Mg2 +浓度梯度均能扩增出条带,但Mg2+浓度2.0 mmol/L时的扩增效果最好；当Mg2 +浓度减少时,扩增条带数目减少且亮度减弱；相反其用量增加时,扩增的条带也表现出了相同的规律.这可能及Mg2 +及激活Taq酶的活性有关系,Mg2 +浓度过低时,Taq 酶的活性难以完全被激活,导致扩增效率降低；而当Mg2 +浓度过高时,Mg2 +会大量鳌合dNTP,从而降低了PCR扩增产物的量(图3).因此实验确定裸果木多态性研究的RAPD反应合适的Mg2 +浓度为2.0 mmol/L.

3为0.3mmol/L；4为0.5 mmol/L

（4） 引物浓度RAPD反应中若引物浓度过高,会导致引物与模板之间的错配,同时还会增大引物二聚体的形成几率；而引物浓度过低会导致扩增不充分,甚至不能扩增.RAPD反应中,设计了0.1、0.2、0.3、0.5 μmol/L等4个引物浓度梯度,0.1～1.0 μmol/L均可扩增出条带,当引物浓度低于0.5 μmol/L时,扩增条带数目少而暗弱,甚至有的位点观测不到；当引物浓度在0.5 μmol/L时,扩增条带清晰明亮,效果最佳,且重复性好；当引物浓度较大时,由于非特异性扩增,导致分辨率严重下降,出现了弥散现象.因此实验确定的裸果木多态性研究的RAPD反应合适的引物浓度为0.3 μmol/L.

2.2.2RAPD方法扩增程序的优化(1)变性时间 实验依次设置了30、40、50 s 3个变性时间.随着变性时间的延长,扩增条带逐渐稳定,在40 s 扩增出的条带清晰(图6).

(2)退火温度 设定了32、34、36、38 ℃共4个温度梯度.当退火温度较低时（32、34 ℃）,扩增条带数少且模糊；36 ℃时扩增的条带最为清晰,分辨率最高；当退火温度高于36 ℃时,条带数目减少的同时,分辨率也明显下降（图6）.因此实验确定合适的退火温度为36 ℃.

2.2.3RAPD反应体系的稳定性检测结果以不同裸果木个体为实验材料,以多态性较好的引物（0～24）,对建立的反应体系的稳定性进行检验,所选择的引物可以扩增出清晰、重复性好的条带,初步表明优化的体系及反应参数是稳定可靠的(图8).

图8优化体系下12个样品扩增的PCR结果（0～24）

Fig.8The PCR results of 12 specimens with peimer 0～24

and optimized reaction system

注：图中1～12为个体编号

最终确定的RAPD反应为：在25 μL反应体系中,模板DNA用量为4.0 ng/μL,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.5 mmol/L,Mg2 +浓度为2.0 mmol/L,Taq酶用量为1 U,ddH2O补足25 μL；94℃预变性5 min；94 ℃变性45 s,36 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环；,最后72 ℃延伸10 min,扩增结果稳定.

3讨论

影响RAPD反应的因素很多,任何一种因子设置不当都会影响整个扩增反应.RAPD反应,对DNA纯度要求不高,但模板DNA浓度是影响RAPD扩增产物产率与特异性的一个重要因子.模板过量,造成引物相对缺乏而抑制扩增反应,使生成的条带减少而出现不同的指纹图.模板浓度过低,不能发生有效的扩增反应或者扩增后图谱变异较大\[16\].在PCR反应中,Mg2+是Taq DNA聚合酶的激活剂,太低或太高都将影响酶的活性,其浓度还影响引物与模扳的解链与退火.一般需将Mg2+浓度控制在大于2 μmol/L,低于此浓度会导致扩增条带的稳定性及可靠性.引物在RAPD反应中是一关键因素.但RAPD扩增反应对引物也没有严格的种属界限,引物的设计除长度较短,为10个碱基左右外,其余规则与一般PCR相同.

dNTPs是PCR反应的底物,其浓度高低会影响到扩增产物的多少.浓度过低,在反应过程中dNTPs被过早消耗完后,会减少扩增产物的产量\[17\]；dNTPs浓度过高时,则会与Taq DNA聚合酶争夺Mg2+,使Taq酶活性降低,不能充分发挥聚合作用而导致扩增失败.

此外,变性时间是影响RAPD反应最重要的因子之一.如变性时间过短,DNA模板将不能充分解链,引物就不能完全结合到DNA模板上,从而导致扩增条带较少；如变性时间过长,会影响Taq酶活力,降低扩增效率,导致扩增结果的不稳定和效率低等问题\[18\].故应参考相关反应体系,在保证条带清晰、稳定的条件下,选择合适的变性时间,保证Taq酶的活性,达到扩增的最佳效果.退火温度对PCR反应的特异性具有非常重要的作用.在RAPD反应中,引物只有10 bp,40 ℃以上的退火温度会影响引物与模板的结合稳定性,所以一般都低于40 ℃.

研究对影响裸果木RAPD扩增体系的一些因子进行了实验和分析,建立了一个比较稳定的RAPD扩增体系.但是要获得重复性较好的结果,除了采用建立起来的最佳体系外,还应将多个裸果木群体同时分析,将特异的标记转化成SCAR来进一步提高其稳定性,以用于横向比较,为资源的保护与利用提供依据.由于对裸果木基因组DNA进行RAPD分析的报道极少,为了寻找适合此次实验的最佳RAPD反应体系,采用单因子梯度设计分别对反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、变形时间及退火温度进行了梯度实验和反应条件的优化.通过优化,获得了稳定性较好,重复性比较高的扩增产物,建立了一套适合裸果木的RAPD反应体系,为进一步对裸果木基因组进行RAPD多态性分析,展开裸果木的遗传多样性研究和种质资源保护提供了有价值的科学参考.

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\[14\]顾红雅. 植物分子生物学实验手册\[M\]. 北京:高等教育出版社,1998:3-12.

\[15\]张庆田,许培磊,李昌禹,等. 五味子的DNA提取及RAPD鉴定研究\[J\]. 中国农学通报,2011,27(2):395-399.

\[16\]杨水莲,刘卫东,马涛,等. 假俭草ISSRPCR反应体系的建立与优化\[J\]. 草原与草坪,2009(1):11-14.

\[17\]范润钧,陈本建,邓波,等. 航天搭载紫花苜蓿SSRPCR反应体系的优化以及引物的筛选\[J\]. 草原与草坪,2010(2):22-27.

\[18\]唐守嵘,王森山,贺春贵. 抗蚜紫花苜蓿品系SSR体系的建立\[J\]. 草原与草坪,2007(3):25-27.

Study on optimization of rapd reaction system for

endangered plant Gymnocarpos przewalskii

WANG Jing1, WANG Haifang2,HUA Limin2,MA Xiying3 ,WANG Liangliang3

(1. Lanzhou Vocational Technology College,Lanzhou 730070,China, 2. College of Grassland Science,Gansu

Agricultural University,Lanzhou 730070,China, 3. Xiaolongshan Forest Experiment Bureau

of Gansu Province,Tianshui 741020,China)

Abstract: To study the RAPD optimal reaction system of G.przewalskii and provide the research basis for RAPD amplification. The DNA templates extracted from fresh lees by CTAB methods,such factors impacted on RAPD analysis as Taq enzymes,Mg2+,dNTP,primer,concentration of DNA template,time of degeneration and temperature were studied,and PCR systems fitted for RAPD reaction of G.przewalskii were established. The reactions were performed in a volume of 25 μL containing 2. 5μL 10×Buffer,2.5 mmol/L Mg2+,Taq DNA ploymerase 1U,0.5 mmol/L dNTPs,0.3μmol/L Primer,and 4.0 ng/μl template DNA. PCR program was 5 min at 94℃ for predenaturation,then 30 cycles of 45 s at 94 ℃ for denaturation,40 s at 36 ℃ for annealing,1 min at 72 ℃ for extension,finally extension at 72 ℃ for 10 min.

Key Words： Gymnocarpos przewalskii,RAPD,reaction system,optimization