本站原创本文是一篇基因论文范文,基因类有关在职研究生毕业论文,关于nm23-H1基因转染L9981肺癌细胞前后基因表达谱的变化相关在职毕业论文范文。适合基因及细胞及统计学分析方面的的大学硕士和本科毕业论文以及基因相关开题报告范文和职称论文写作参考文献资料下载。
摘 要：应用基因芯片检测L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞基因表达谱的改变.提取L9981细胞转染nm23-H1基因前后细胞的总RNA,纯化为mRNA后再转录为cDNA.cDNA经限制性内切酶Sau3AI消化后,cDN段分别用cy3和cy5标记,与的包含14000个基因芯片杂交.杂交结果经扫描和软件分析,nm23-H1基因转染L9981细胞后发现1156(8．26％,1156/14000)个基因表达上调,而642(4．59％,642／14000)个基因表达下调.涉及基因包括信号传导、癌基因与抑癌基因、转移相关基因、细胞周期与凋亡、细胞外基质与细胞骨架相关基因,以及细胞因子和转录因子等.nm23-H1基因是通过对转移相关基因的调节来发挥其抑制肺癌细胞株L9981侵袭和转移作用的.
关 键 词：L9981；基因芯片；基因表达；nm23-H1基因
中图分类号：R734．2；Q813．1
文献标识码：A
文章编号：1007―7847(2006)01―0077―05
nm23-H1基因已被证明是肿瘤转移抑制基因.将nm23-H1基因的cDNA转入nm23-H1基因表达缺失的人高转移大细胞肺癌细胞株L9981,可以逆转其恶性表型.但是nm23-H1抑制肺癌侵袭与转移的分子机制尚不十分清楚,我们以往的研究表明,nm23-H1基因抑制肿瘤侵袭与转移可能是通过对转移相关基因的调控实现的,为进一步研究nm23-H1作用的分子机制,我们应用基因芯片检测了nm23-Hl转染L9981前后相关基因表达的变化.
1材料与方法
1．1材料
l,1．1细胞株
1)L9981(高转移大细胞肺癌细胞株)；2)L9981－nm23-H1(稳定表达nm23-H1基因的L9981细胞株).均由四川大学华西医院四川省肺癌分子重点实验室提供.
1．1．2常用试剂及设备
精制小牛血清和RPMIt640培养基购自Hy－clone公司；用120mmol／L的NaOH溶液配成lmmol／L的贮备液,4℃贮存.SuperScriptTMIIRNaseH-ReverseTranscriptase(1nvitrogenCat．No．18064-014),dATP、dGTP、dCTP、dTYPOligod(T)Primer(Bioasia合成),Cy5(Amersham,Cat,No．PA55021),Cy3(Amersham,Cat．No．PA53021),RNAinhibito(Takara,Cat．No．D2311A),OlAquickNucleotideRemovalKit(OIAGEN,Cat,No．28306)Genemachine：型号OmniGrid100Pixsys5500芯片打印仅购自Carte―sian公司,ScanArrayLite芯片扫描仪及其分析软件Quantarray购自GsiLumonics公司,玻片及芯片杂交盒购自Coming公司.
1．1．3基因芯片
项目所用芯片版本号为2．2人cDNA基因表达谱芯片,产品目录号为SBC-R-HC-100-22．芯片编号为17874,17873(上海生物芯片工程公司).
1．2方法
1．2．1总RNA的纯化
(RNeasy MiniKit)应用QIAGENRNeasyKit纯化总RNA,详细操作原理和方法见RNeasyMiniProtoc01.
1,2,2总RNA质量检测
(Labonchip检测)具体操作步骤参考人cD-NA表达谱芯片使用手册,SBC-H―HC-100-22,具体结果见《样品质检报告》.Lab-on-chip参照Agi-lent2100分析仪操作手册,制备凝胶,按照软件提示进行RNA电泳操作,评价RNA质量.
1．2．3样品制备
cDNA用Sau3Al酶切后接上接头,之后用PCR通用引物扩增.PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后取出500ng.实验标记方法采用cDNA直接标记法,其中实验组RNA(L9981－nm23-H1)采用cy3荧光标记,对照组RNA(L9981)RNA采用荧光cy5标记.加入Cy3／Cy5标记的引物(100lLm01／L)21lL(NaOH作用的对照组用Cy5标记,As20,作用的处理组用Cy3标记),同样条件再行PCR扩增和纯化,将PCR产物终浓度调至200mg／L.
1,2．4杂交
标记后的样品95℃变性后加到经预杂交的芯片阵列表面,轻轻覆上盖玻片,放人杂交盒内,42℃杂交18h.
1．2．5检测与分析
芯片结果采用Agilent扫描仪进行扫描,Ima-gene软件读取数据Scanresolution10μm,PMT100％,最后采用Genespring进行Normalize处理分析,最后ratio值为cy3／cy5,即实验组／对照组．差异基因筛选标准：(1)ratio>或等于2为上调基因,ratio喊等于0．5为下调基因.
1．3统计学分析
聚类分析法.应用genespring和cluster分析软件进行聚类分析.
2结果
2．1细胞的总RNA电泳图
两株细胞(L9981,nm23―H1和L9981)总RNA抽提纯化后,1％的琼脂糖凝胶电泳可以看到明显的28、18、5S条带,并且28S的条带明显亮于18S带；70℃水浴保温1h后的电泳图与水浴前的电泳图无明显差异,证明所提取的总RNA质量及完整性均很好(图1).
2．2基因芯片杂交结果和分析
再将Cy5和Cy3的扫描图像完全重叠,得到的杂交图中(图2),红色点表示低表达,绿色点表示高表达,黄色点表示表达水平无改变.图经软件分析后,得到芯片杂交的散点图(图3).每个点的Y轴表示Cy3的杂交信号的相对强度,X轴表示Cy5杂交信号的相对强度.45°角直线(实线所示)上的点Cy5／Cy3的比率为l,表示无差异表达,远离45°角直线的点为差异表达,离的越远,表示差异越大,落在2条虚线以外的点即是Cy3／Cy5的比率大于2或小于0．5的点.
2.3基因芯片筛选结果
nm23-H1基因转染L9981细胞前后差异表达基因共l792条,其中基因表达增加(上调)为1156条,表达减少(下调)为642条．在表达上调的基因中有未知功能的基因1035条,而功能清楚的基因121条,其中包括：细胞周期与凋亡基因31条、癌基因0条,抑癌基因18条、转移相关基因12条,细胞因子与转录因子13条,细胞信号与蛋白相关基因38条,细胞外基质与骨架蛋白9条,在表达下调的基因中有541条功能不明的基因,而已知基因有101条,其中包括：细胞周期与凋亡基因12条、癌基因11条,抑癌基因3条、转移相关基因14条,细胞因子与转录因子21条,细胞信号与蛋白相关基因27条,细胞外基质与骨架蛋白13条(见表1).
3讨论
nm23-H1基因是肿瘤转移抑制基因,它的低表达和缺失与肺癌的侵袭和转移密切相关．我们的前期研究发现nm23―HI基因蛋白和mBNA低表达、突变,等位基因缺失与肺癌的高转移性和预后不良有密切关系.具有高转移潜能的人高转移大细胞肺癌L9981细胞中存在nm23-HI等位基因的杂合性缺失,L9981细胞在体外具有较强的克隆形成能力和侵袭力,在裸鼠体内的自发性肺转移能力为100％.以往的研究表明将nm23-HI基因导入L9981细胞株可以逆转其恶性表型,表现为体外增殖能力,克隆形成能力,侵袭力,和自发性裸鼠肺转移能力显著降低.周清华等的研究发现伴有nm23-H1基因缺失的肺癌常伴有一些肿瘤侵袭相关分子的表达异常,并推测nm23-H1基因可能为“肺癌转移抑制级联”相关基因的上游调节基因,它对肿瘤转移潜能的抑制作用是通过调控下游基因实现的.但是nm23-HI基因逆转肺癌恶性表型的分子机制尚不清楚.
利用基因芯片技术为我们研究nm23-H1基因结构和功能的变化对肺癌侵袭和转移的分子机制提供理想的技术支持,基因表达谱芯片具有高通量、大规模、快速高效和灵敏度高的特点,可以分析两组或两组以上不同来源的mRNA丰度的差异,通过计算杂交信号的比值和统计分析,可以获得差异表达基因信息.
本实验利用肿瘤基因表达谱芯片分析nm23-H1基因转染L9981细胞前后相关基因的表达改变,基因表达谱芯片的应用为研究nm23-H1基因作用的分子机制提供了相关基因的基因组学证据,突破了以往单个基因孤立研究的局限,特别是采用将外源基因导入不表达该基因的细胞,避免了标本取样的组织学差异,使实验结果数据更加可靠,更加便于分析,本研究应用包含14000种基因的SBC-R-HC-100-22cDNA基因表达谱芯片,对L9981细胞转染nm23-Hl基因前后进行分析,通过比较两者基因表达的差异信息,寻找与nm23-H1基因表达相关的基因,本研究共筛选出差异表达基因1792个,转染nm23-Hl基因后,基因表达上调的基因有1156条,其中有1035条基因的功能不清楚,而已知基因有121条；而基因表达下调的基因有642条,其中有541条是未知基因,101条是功能清楚的基因．在上调和下调的已知基因中包括：细胞周期与凋亡基因、癌基因,抑癌基因、转移相关基因,细胞因子与转录因于,细胞信号与蛋白相关基因,细胞外基质与骨架蛋白.在表达上调的基因中有较多是与肿瘤的转移相关的基因,主要有E-Cad、beta-catenin、nm23和TIMP-1、2等,而表达下调的与肿瘤转移相关的基因主要有：Ras、VEGF、PDGF-A、Erk-／、2、c-src等.这些研究结果与我们以往的研究结果一致.
但是本研究也发现nm23-H1基因的高表达也可以使一些抑癌基因高表达、细胞因子和转录因子的活性增强,提高细胞外基质酶的活性,影响细胞骨架蛋白的合成.因此可以推测nm23-H1基因可以通过多种途径抑制肿瘤细胞的侵袭与转移,如通过对细胞周期和凋亡相关基因的调控抑制细胞的增殖能力和克隆形成率,降低基质金属蛋白酶的活性,抑制促进血管生成基因的表达,进而抑制肿瘤的侵袭与转移.由此可见,nm23-Hl基因对L9981细胞恶性表型的逆转是通过对下游相关基因的调控实现的,并且是“肺癌转移抑制级联”中的正向调控的关键基因和上游基因.
总之,肿瘤的侵袭和转移是多基因、多因子共同作用的结果,并且是一至两个关键基因在时间上和空间上相互配合,协同促进了细胞的癌变、侵袭和转移.因此,在研究肿瘤侵袭与转移的分子机制时,也应进行多基因的分析,而不只是局限在几个单一基因上,基因芯片为研究肿瘤的发生、发展及基因之间的相互作用提供了有力的研究工具.
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