马兜铃酸含量测定技术

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[摘 要]目的 优化高效液相色谱法对马兜铃酸进行含量分析.方法 通过比较不同提取溶剂、不同提取方法,确定较为合理的供试品溶液制备方法.比较不同流动相条件对马兜铃酸含量测定的影响,选择含量分析色谱条件.测定不同波长下的最低检出限度,确定痕量分析条件.结果 供试品溶液制备中以70%甲醇直接加热回流提取,效率优于其他提取方法.做一般含量分析时可以选择流动相为甲醇-1%醋酸水溶液（70∶30）或乙腈-0.3%（NH4）2CO3（pH等于7.5） （25∶75）,250 nm或319 nm作为检测波长.做痕量分析时宜选择流动相为乙腈-0.3%（NH4）2CO3（pH等于7.5）（25∶75）,并选择检测波长为224 nm,最小检出量可达0.02 ng.结论 本实验所建立的方法可以准确可靠的进行马兜铃酸含量分析并进行痕量检查.

[关 键 词 ]马兜铃酸 含量测定

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）01-0000-01

马兜铃酸是马兜铃科植物中的主要成分,近年来已证实其具有肾脏毒性.鉴于马兜铃科植物种类很多,名称混淆现象也很常见,各地方用药种类十分复杂,所以,有必要建立一个简单有效、便于推广的方法对马兜铃酸进行定量分析,以便真实准确地反映出药材或制剂中马兜铃酸的含量,保证用药安全.目前,高效液相色谱法是在马兜铃酸含量测定中使用最多、发展也较为成熟的一种方法,但测定条件多种多样.为此,本试验从供试品溶液的制备、色谱条件的选择两个方面进行了研究,以期建立并推荐一个能准确反映马兜铃酸含量的高效液相色谱法.

一、仪器与试剂

美国科普公司SSIPC3000高效液相色谱仪,Model 500紫外检测器,HORIBA B-212PH计,Anastar色谱工作站.色谱纯试剂购自天津康科德化学试剂厂,分析纯试剂购自山东禹王化学试剂厂.关木通（两年生）采自沈阳药科大学药用植物园,马兜铃酸A对照品购自中国生物制品检定所（批号110746-200204）.

二、供试品溶液的制备

1.提取溶剂的选择

现有的研究中,马兜铃酸的提取溶剂多数选择甲醇、乙醇、丙酮或加入一定量的酸来提取,有文献报道,丙酮-10%甲酸提取效率较高.我们也重点考察了该浓度酸及常用溶剂对提取效率的影响.取干燥关木通药材粉末（40目）,精密称定30份,各0.5g,分别加入溶剂各20mL,每种溶剂各提取2份,共30份,分别浸泡2h,超声15min,过滤,滤液蒸干,残渣以甲醇溶解,定容至10mL容量瓶中,微孔滤膜过滤后,供HPLC测定用.

从实验数据看,甲醇、乙醇不适宜对马兜铃酸进行提取,加入酸或醇水溶液,可使马兜铃酸的提取效率显著增加,综合比较各种溶剂,70%甲醇对马兜铃酸的提取效率最高,可以作为马兜铃酸的最优提取溶剂.

2.提取方法的选择

①索氏提取法：取0.5g关木通药材粉末4份,以70%甲醇120mL分别索氏提取1、2、3.5、5h,分别测定含量,结果表明3.5h后峰面积不再增加.②直接加热回流法：取关木通粉末1份,提取溶剂为70%甲醇25mL,提取1h,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取2次,分别得滤液并测定含量.结果表明,关木通提取1次即1h即提取完全.③超声提取法：取关木通粉末1份,提取溶剂为70%甲醇25mL,提取15min,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取4次,分别得滤液并测定含量,结果表明,关木通重复提取4次即1h,即提取完全.

可以看出,在提取完全的情况下,超声提取法需提取4次,耗费1h,消耗溶剂共100mL；索氏提取法需提取3.5h,消耗溶剂120mL；直接加热回流法需提取1次,提取1h,消耗溶剂25mL,即可提取完全.故建议选择直接加热回流法提取.

三、色谱条件

1.流动相对马兜铃酸含量测定的影响

从大量的文献报道来看,马兜铃酸含量测定的流动相一般使用甲醇-水系统、乙腈-水系统[2],另有采用乙腈-0.3% （NH4）2CO3（pH等于7.5）[3]系统,本试验对不同流动相系统[甲醇-水-冰醋酸（70∶30∶1）、乙腈-水-冰醋酸（50∶50∶1）、乙腈-0.3%（NH4）2CO3（pH等于7.5,25∶75）]进行了比较.

可以看出,3种流动相条件均可与其他成分实现基本分离,理论塔板数也符合定量分析的要求,但在乙腈-水系统下,马兜铃酸计算含量偏低.

2.低酸度对色谱分离的影响

由于马兜铃酸属于酸性物质,流动相中加入适量的酸可以改善峰形,但是酸的加入将会影响色谱住的使用寿命,本节探讨不同酸度对马兜铃酸分离的影响.

可以看出,甲醇-1%醋酸水溶液流动相条件分离度良好,理论塔板数符合定量分析要求,降低酸度不影响色谱分离,甲醇-1%醋酸水溶液适合作为含量测定的流动相条件.

3.痕量分析时色谱条件的选择

仪器及方法的检测限度是进行马兜铃酸痕量分析的重要指标,为确保用药的安全性,要求色谱条件具有较低的检测限.马兜铃酸有4处最大吸收,即224、250、319、390 nm.取配置好的0.05 mg/mL马兜铃酸对照品溶液,采用无限稀释法,流动相选择甲醇-1%醋酸水溶液及乙腈-0.3%（NH4）2CO3（PH等于7.5）,并配以不同检测波长进行最低检出限度的考察.

可以看出,乙腈-0.3%（NH4）2CO3（pH等于7.5）配以224 nm检测波长可以获得最低的检出限度,该条件可用于限度检出.

此外,根据样品在不同波长下的最低检测限可以看出,样品在390 nm处检测限较高,不适合作为马兜铃酸含量测定时的检测波长,而250 nm及319 nm检测波长下检出限较低（<1 ng）,信号相对较高,适合作为含量分析的检测波长.同时,考虑到224 nm检测波长在复杂样品分析时易出现杂质峰干扰,不建议作为含测检测波长.

四、讨论

本试验对高效液相色谱方法测定马兜铃酸含量的供试品溶液的制备方法进行了条件优化选择,确定供试品溶液的制备方法为70%甲醇直接加热回流法进行提取.

在流动相选择上,研究发现,甲醇-1%醋酸水溶液（70∶30）及乙腈-0.3%（NH4）2CO3（pH等于7.5）可以满足马兜铃酸含量分析需要,结果较为准确.当药材中马兜铃酸含量较低,需进行痕量分析时宜选择流动相为乙腈-0.3%（NH4）2CO3（pH等于7.5）,检测波长为224 nm.

本试验首次对甲醇-水分离马兜铃酸的酸度进行了考察,发现采用低酸度的甲醇-1%醋酸水溶液对马兜铃酸进行含量测定,不仅可以获得良好的分离效果,且可以减缓流动相对色谱柱的损耗,适宜用作马兜铃酸的含量测定方法.