人乳牙根生理性吸收过程中破牙细胞RANKL表达的

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[摘 要 ] 目的 观察核因子κΒ受体活化剂配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand,RANKL)在人乳牙根生理性吸收过程中的表达,为进一步探讨RANKL与人乳牙根生理性吸收机理的关系增添新的实验资料.方法 收集人乳牙根生理性吸收早期、中期、晚期的乳牙和因正畸拔除的前磨牙,运用免疫组织化学的方法检测人乳牙根生理性吸收过程中破牙细胞RANKL的表达.结果 乳牙牙髓破牙细胞胞浆中免疫组化染色阳性,且表达高于恒牙组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 RANKL在人乳牙根生理性吸收过程中早期、中期和晚期表达有差异,推测其可能在人乳牙根的生理性吸收过程中有一定的意义.

[关 键 词 ] 乳牙根生理性吸收； 破牙细胞； RANKL

[中图分类号] R336[文献标识码] B[文章编号] 1005-0515（2011）-11-044-02

乳恒牙的替换包括乳牙根的吸收、恒牙胚的发育、恒牙的萌出,其中乳牙根的吸收是一种重要的生理现象,此过程由多核的破牙细胞介导,最终导致乳牙脱落,但其具体机制目前尚不清楚.破牙细胞在形态、结构、功能上与破骨细胞具有相似性[1].RANKL是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员,是表达于破骨细胞表面核因子κΒ受体活化剂(receptor activator of nuclear factor-KB,RANK)的配体,RANKL通过与其结合后经过一系列复杂的分子生物学过程介导破牙细胞的分化成熟,导致乳牙根的吸收.本实验通过观察RANKL在人乳牙根生理性吸收过程中的表达分布来探讨其在人乳牙根生理性吸收过程中的作用.

1.实验分组与方法

1.1 实验分组 乳牙根生理性吸收早期、吸收中期、吸收晚期乳前牙各10颗,共计30颗；对照组：因正畸拔除的前磨牙10颗.

选取2010.10-2011.03,6-15岁就诊于山西红十字口腔医院儿童牙病科和正畸科因治疗需要拔除的乳前牙和恒前磨牙,选取乳前牙牙根吸收低密度影最高点,按临床统计学数据冠根比1:1.7计算牙根吸收长度,将收集的牙按牙根吸收长度不同分为牙根吸收早、中、晚期.

乳牙牙根吸收分期标准:牙根吸收在根尖1/3为早期；牙根吸收在根中1/3为中期；牙根吸收在根颈1/3为晚期.

1.2 实验方法

1.2.1 石蜡切片的制备与HE染色 收集的牙齿用生理盐水清洗干净,立刻置于中性固定,然后将标本置于15%EDTA脱钙,脱钙完成后,经过浸蜡,包埋,自牙根向牙冠,沿牙体中线通过髓腔切5μm连续切片.

1.2.2 免疫组织化学染色 经APES处理的切片脱蜡至水,蒸馏水洗,3%H2O2室温孵育,0.01mol/L PBS浸泡,复合消化液10min,0.01mol/L PBS洗,正常兔血清封闭液室温孵育15min,倾去,不洗,滴加一抗RANKL(兔抗人多克隆抗体,武汉博士德生物工程有限公司,武汉)(抗体滴度1:200)(空白对照切片滴加PBS替代一抗)4oC过夜；生物素标记兔抗人IgG二抗工作液室温孵育15min, 免疫组化检测试剂盒SABC(兔IgG)(武汉博士德生物工程有限公司,武汉),DAB显色(武汉博士德生物工程有限公司,武汉),显微镜下控制显色时间,苏木素轻度复染,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察.

1.2.3 结果判定 按实验分组选取经免疫组化染色的切片每组各30张(每隔5张选择一张切片做免疫组化染色用,每个标本取3张切片),运用Bi2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)对实验组每张切片阳性着色的破牙细胞分别随机选取10个视野进行平均光密度值(integral optical density,OD)测定,取其平均值.

1.3 统计学处理 运用SPSS 17.0统计分析软件分别对实验组和对照组的破牙细胞的光密度值进行one-way ANOVA检验,检验水准α等于0.05,比较各组间差异.

2.结果

2.1 免疫组织化学染色观察 乳牙根吸收早期：牙髓组织尚处于正常,少量吸收部位对应的成牙本质细胞排列紊乱.成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞、破牙细胞RANKL胞浆染色较浅(图1).

图1乳牙根吸收早期牙髓组织织RANKL免疫组织化学染色阳性

(SABC法 ×250)(绿色箭头代表破牙细胞)

乳牙根吸收中期：牙髓内纤维组织增加,炎症细胞浸润明显,接近吸收部位的成牙本质细胞排列更加紊乱,甚至有些部位出现变性,消失.位于其下方的破牙细胞数量增多,体积大,形态不规则.成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞、破牙细胞RANKL胞浆染色较深(图2).

图2乳牙根吸收中期牙髓组织织RANKL免疫组织化学染色阳性

(SABC法 ×250)(绿色箭头代表破牙细胞)

乳牙根吸收晚期：大部分牙髓正常细胞减少,成牙本质细胞基本萎缩,消失,破牙细胞位于牙髓腔近牙本质,肉芽组织接近吸收面.成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞、破牙细胞RANKL胞浆染色较深(图3).

图3乳牙根吸收晚期牙髓组织织RANKL免疫组织化学染色阳性

(SABC法 ×250)(绿色箭头代表破牙细胞)

恒牙组：牙髓组织正常,有少量炎症细胞浸润,未见破牙细胞,成牙本质细胞、牙髓成纤维细胞RANKL胞浆染色阴性.

2.2 免疫组织化学染像分析和统计学处理结果 破牙细胞RANKL的表达在乳牙根生理性吸收中期组与吸收早期组、晚期组比较均有显著的统计学意义(P＜0.05).恒牙组中未发现破牙细胞(表1).

表1破牙细胞中RANKL免疫组织化学光密度值统计结果

F等于37.669,P＜0.05.

3.讨论

3.1 RANKL的结构、功能以及与破牙细胞的关系 RANKL是肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的Ⅱ型跨膜蛋白,是成骨细胞系和活化的T细胞系分泌的由317个氨基酸组成的肽链.成骨细胞系分泌的RANKL位于细胞膜,而T淋巴细胞系分泌的RANKL为可溶性的(s-RANKL).

RANKL-mRNA在骨、骨髓和淋巴组织中高表达[2].对细胞的超微结构进行的比照研究显示: 吸收牙本质或牙骨质的破牙细胞、吸收牙釉质的细胞、与破骨细胞超微结构均非常相似[3].进一步研究表明成骨细胞与骨髓基质细胞表面表达RANKL,RANKL与RANK结合促进破骨细胞形成、融合、分化、活化和增殖,促进骨的吸收[4].而骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)与RANKL介导的生物学效应相反,该分子可以竞争性的与RANKL结合,而阻断RANK与RANKL的结合,从而抑制了RANKL的生物学活性[5].

破牙细胞前体细胞可能来源于循环系统母细胞,为TRAP染色阳性的单核细胞,其分化受多种因子的调节.核因子一KB受体活化因子配体(RANKL)是肿瘤坏死因子(TNF)配体家族成员,能与核因子一KB受体活化因子(RANK)结合,通过一系列酶促级联反应引起破牙细胞的活化.OPG能竞争性地与RANKL结合,阻断RANK与RANKL间的相互作用.OPG通过抑制成熟破牙细胞皱褶边缘的形成,并加速破牙细胞程序性死亡.因此,OPG、RANKL、RANK是破牙细胞活化的分子基础[6].

3.2 RANKL在乳牙根生理性吸收过程中的作用 本实验观察到,在人乳牙根生理性吸收阶段,乳牙牙髓组织破牙细胞中RANKL表达阳性.Rani和MacDougall等学者[7]证实RANKL-mRNA和RANKL在乳牙牙髓细胞,成牙本质细胞,破牙细胞,牙周膜细胞等表达阳性.Lossdorfer[8]于人乳牙中检测到了RANKL蛋白的表达.上述学者的发现支持我的实验结论.本实验观察到破牙细胞RANKL免疫组织化学染色阳性,可以推测破牙细胞不但受外源性RANKL的调节,而且同时也受自身分泌RANKL的调控来达到自身的分化成熟.本实验还观察到RANKL免疫组织化学染色在同一牙齿组织有不同强度的阳性表达,可以推测RANKL在细胞分化的不同阶段有不同数量的表达.综上所述,我们推测RANKL在乳牙牙髓中的阳性表达可能与乳牙根的生理性吸收有关,但成牙本质细胞与牙髓成纤维细胞表达的RANKL是否参与了破牙细胞的激活与成熟,如何介导破牙细胞,如果介导后RANKL信号传导的路径如何,受哪些因子的调控还需要进一步的研究.