尿中马多的快速方法

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[摘 要 ]目的：通过考察尿中马多及其代谢物的提取方法,建立其气相色谱-质谱(GC-MS)的检测方法.方法：采用C18固相萃取法对尿中原体及其主要代谢物进行提取,利用GC-MS对其进行检测.结果：线性范围为0.1~100μg/ml（r等于0.9957,n等于6）,平均回收率为99.21%,相对标准偏差为2.83%,最低测量限为 0.1 g/ml .结论：本实验研究建立了尿中及其代谢物的快速、简便、准确、灵敏的检测方法,可作为快速检测吸毒人员尿中是否含有的一种有效的方法.

[关 键 词 ]；代谢物；气相-质谱法；固相萃取

[中图分类号]O657[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）05（b）-009-03

The rapid analysis method of tramadol hydrothloride injection in urine

JIANG Wei

（Shengjing Hospital,Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China）

[Abstract] Objective：To examine the optimal extractive conditions of tramadol and its metabolite from urine and establish a detection method of tramadol by GC-MS. Methods：A solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry(SPE-GC-MS) procedure for the simultaneous detection of tramadol and its main metabolite in urine has been developed.Results：The linearity of the tramadol solution from 0.1 g/ml to 100 μg/ml is fine ,and correlation coefficient is 0.9957.The erage recovery was 99.21%,and the relative sandard deviation was 2.83%.Conclusion：It is a rapid,simple,accurate and sensitive method.It is also an effective method for rapid detection whether there is tramadol in urine of druggy.

[Key words]Tramadol；Metabolites；Solid-phase extraction；Gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS)

（tramadol或tramal,TR）又名曲马朵,是由德国格兰泰公司在20世纪60年代早期开发研制的强效中枢镇痛药,并于1977年投放德国市场.在欧美国家已使用多年,对中度至重度疼痛被认为是有效且安全的[1],由于滥用潜力极低,故国外在上市后20年的临床应用中很少发生滥用案例.但近几年来已有报道有成瘾及过量致死案例[2,3].一些吸毒者在滥用的同时滥用安定等精神药物,据称可产生类似、样欣快感[4].我们在一些吸毒者尿样中也检出及其代谢物成分,说明吸毒者已认识的作用,须引起重视.

1.材料与方法

1.1 方法

以GC-MS法,通过对化合物的结构分析,研究裂解方式,从而为确定结构提供依据.采用内标法进行定量.即用SKF-525A作为内标物质,以样品中待测组分与内标物的峰面积比值进行计算.具体公式如下：

CTR与ATR分别代表检材的浓度及相应的峰面积.C标及A标分别代表标准溶液的浓度及相应的峰面积, A标代表内标物的峰面积.

1.2 实验材料及试剂

1.2.1 仪器美国Thermo 公司气相-质谱联用仪,固相萃取柱: MT型C18固相柱（天津市富集科技有限公司）,WH-3微型旋涡混合仪（上海泸西分析仪器厂）,80-2离心沉淀器（上海分析器械厂）,AS-5150A型超声仪(奥特赛斯机器有限公司).

1.2.2 试剂马多（中国药品生物制品检定所）；SKF-525A（内标物,物证鉴定中心）；甲醇（优级纯,北京化工厂）；三氯甲烷、、环己烷、异丙醇均为分析醇.

1.3 溶液的配制

1.3.1 标准溶液配制精密称取马多50 mg,置100 ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度.精密量取5 ml,置50 ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为标准溶液备用.

1.3.2 内标溶液配制精密称取SKF-525A 5 mg,置50 ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,得到内标溶液备用.

1.3.3 缓冲溶液（pH＝10.58）的配制0.05 mol/L碳酸钠与0.1 mol/L碳酸氢钠按9∶1比例混合.

1.4 尿样中萃取方法的筛选

1.4.1 液-液萃取取2 ml空白尿液,共5份,分别置10 ml离心试管中,分别添加标准溶液100 μl和内标溶液30 μl.然后用缓冲溶液调节pH值至9.5.向上述5个10 ml离心试管尿液中,分别加入4种不同的提取溶剂：氯仿∶异丙醇（9∶1,v/v）、环已烷、氯仿、提取（各加3 ml）,然后置旋涡混合器上旋涡10 min,离心10 min,提取有机层,剩下的水层再用3 ml有机溶剂提取,旋涡,离心,合并有机层,并用氮气流吹干,然后用甲醇溶解并定容至0.5 ml,取0.4 μl进样 ,用GC-MS分析,测定结果见表1.

1.4.2 固相萃取固相萃取分两种情况进行实验,一种为柱前调节pH,另一种为柱上调节pH.

1.4.2.1 柱前调节pH：取2 ml空白尿液共3份,然后分别添加标准溶液500 μl和内标溶液30 μl,在尿液中添加pH 10.58的缓冲液直至pH调至9.5,用2 ml甲醇淋洗小柱使其活化并保持湿润,然后取上述3份空白尿样过柱(如果尿样浑浊,离心后取上清液,过柱),依次用5 ml蒸馏水淋洗小柱,将其吹干,再用2 ml甲醇洗脱小柱,收集洗脱液,在氮气下吹干.最后用甲醇溶解并定容至0.5 ml,取0.4 μl进样,用GC-MS分析,测定结果见表2.

1.4.2.2 柱上调节pH：取2 ml空白尿液共3份,在尿液中分别添加标准溶液500 μl和内标溶液30 μl.先用2 ml甲醇淋洗小柱使其活化,再用pH 10.58的缓冲溶液2 ml调至碱性,使柱保持湿润,取上述3份空白尿样过柱(如果尿样浑浊,离心后取上清液,过柱),然后依次用5 ml蒸馏水淋洗小柱,将其吹干,再用2 ml甲醇洗脱小柱,收集洗脱液,在氮气流下吹干.然后用甲醇溶解并定容至0.5 ml,取0.4 μl进样,用GC-MS分析,测定结果见表2.

1.5 回收率和准确度考察

取空白尿2 ml 15份,其中以5份为一组分成三组考察低、中、高3个浓度样品的绝对回收率.具体步骤如下：取5份空白尿,分别添加标液30 μl和内标溶液30 μl,最后用甲醇溶解并定容到0.5 ml,进样0.4 μl,用GC-MS分析.同法对30 μg/ml和50 μg/ml两组样品进样分析.本实验以经过过柱处理的溶液 在标准曲线上对应的浓度与添加浓度之比来考察3、30、50 μg/ml三种浓度的回收率与准确度（表3）.

1.6 提取回收率及精密度考察

按上述方法制得三种浓度溶液,每种5份,另外配制该3种浓度的对照品溶液各1份,测得提取回收率如表4.

按上述方法制得上述三种浓度溶液,连续测定5 d,分别得日内、日间标准偏差差异及提取回收率.结果见表5.

2.结果

2.1 （TR）质谱图特征峰m/z 58、188、218、263分别来自

M1质谱图特征峰m/z 58同TR,而特征峰121、174、204、249比TR少14质量单位为O-去TR；M2质谱图特征峰m/z135、188、218同TR,而特征峰m/z44、249比TR少14质量单位为N-去TR；M3质谱图特征峰m/z 58、135同TR,而特征峰m/z 234、279比TR少16质量单位为羟化TR.

2.2 根据以上实验,应用气相色谱-质谱(GC-MS)的检测方法得出的最终数据是：线性范围为0.1~100 μg/ml（r等于0.9957,n等于6）,平均回收率为99.21%,相对标准偏差为2.83%,最低测量限为 0.1 μg/ml.

3.讨论

3.1 本实验做了对相同浓度的进行液-液提取和固相萃取时对提取回收率的比较,表1和表2提供了提取回收率的数据.

3.2 在液-液提取实验中,由于易溶于有机溶剂,因此选择对提取率较高的溶剂氯仿∶异丙醇（9∶1,v/v）、环已烷、氯仿、进行液-液提取,在GC-MS图谱中,氯仿和环己烷提取效果好,相对标准偏差较小,杂质少.由表1所示的数据显示,在无固相萃取条件时可采用氯仿和环己烷作为提取溶剂.

3.3 在用C18柱固相萃取法中,通过对碱性调节的先后得出的柱回收率的比较,我们知道在柱上调节PH值可提高方法的回收率,因此我们采用在活化后C18柱上过pH为10.58的缓冲液的方法来进行实验.

3.4在液-液提取进行涡旋时,水层和有机层之间常常出现透明的胶体,处理较麻烦,影响回收率值较大.固相萃取法比液-液萃取法有很多优点,首先使用的有机溶剂少；其次是操作方法简便,可以省去在液-液萃取中使用涡旋,离心等步骤所造成的损失,提取效果好,杂质少,大大增加了提取回收率,并且不易产生乳化现象,节省时间,缩短样品的挥干时间,而且固相萃取的回收率高于液-液萃取的回收率.

3.5 为配合禁毒工作,机关经常需要对吸毒嫌疑人员进行检验,认定滥用药物种类.主要经肝脏代谢,由于的半衰期短,因此吸毒人员尿液中可以以原体及主要代谢物的状态被检测出来,但由于人尿液中干扰物质较多,一般GC-MS方法很难满足检验需要.本文建立的固相萃取GC-MS法,适用于快速检验吸毒人员尿液中及其代谢物成分,方法快速、简便、灵敏、准确,可作为机关快速检验吸毒人是否含有的一种有效的方法.

（致谢：本实验得到了辽宁省厅化验室的支持,在此表示感谢!）

[参考文献]

[1]Hernabdez AF,Montero MN,Pla A,et al.Fatal moclobemide overdose or death caused by serotonin syndrome[J].J Forensic Sci,1995,40(1):128-130.

[2]Lusthof KJ,Zweipfenning PG.Suicide by tramadol overdose[J].J Anal Toxicol,1998,22(3):260.

[3]Goeringer KE,Logan BK,Christian GD.Identification of tramadol and its metabolites in blood from drug-related deaths and drug-impaired drivers[J].J Anal Toxicol,1997,21（7）:529-537.

[4]刘志民,张开镐. 的不良反应及药物依赖性[J].药物流行学杂志,1999,8：150-152.

（收稿日期：2007-03-26）

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