免疫透射比浊法与干化学法测定血清白蛋白的方法学比较偏倚评估

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【摘 要】目的通过评估免疫透射比浊法与干化学法测定ALB的偏倚,探讨两种方法检测ALB结果间的偏差是否在允许的范围,保证检测结果的可比性.方法依据NCCLS标准化文件EP9-A2[1],每天取临床样本8份,分别用免疫透射比浊法与干化学法进行双份测定,共测定5d,去除离群点,计算相关系数及预期偏差,以CLIA’88规定的室间质评(ALB+10%)允许误差的1/2作为方法比较结果系统误差的允许限值,进行偏倚的评估.结果干化学法与免疫透射比浊法比较,r2等于0.934,在医学决定水平20g/L,35g/L,52g/L时,干化学法的预期相对偏倚分别10.4%,6.8%,3.2%,在Xc等于20g/L及Xc等于35g/L时,两种方法存在统计学差异.结论以免疫透射比浊法作为比较方法,干化学法测定ALB的结果存在正偏差,测定结果的偏差随着ALB浓度的减低而增大,在低浓度时差异更显著,两者相关性差.因此,实验室内使用不同分析方法检测同一分析物时,建议对各方法进行方法学比较及偏倚评估,明确方法间的差异,并建立各方法的参考范围,特别是建立不同方法在不同医学决定水平浓度的参考值,以保证检测结果的可比性.

【关 键 词】血清白蛋白,免疫透射比浊法,干化学,偏倚

TurbidimetricImmunoassayMethodandDry-slideBromocresolGreenMethodin(ALB)SerumAlbuminDetermination:

AMethodologicalComparisonandBiasAssesent

FENGPin-ning,GAOLing,YUXiong-wen,etal.

LaboratoryMedicineDepartmentoftheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

【Abstract】ObjectiveThearticleparesthebiasassesentsofturbidimetricimmunoassaymethodanddry-slidebromocresolgreenmethodinALBdetection,anddiscusseswhetherthebiasofthetwodetectionresultsarewithintherangepermitted,soastoensuretheparabilityoftheresults.MethodAccordingtoNCCLSstandardizationdocumentEP9-A2[1],firstly8clinicalsamplesaredailytakenandtestedduplicatesundereachmethod,altogetherfivedays.Nexttheoutlierpointsareexcludedandcorrelationcoefficientsandexpecteddeviationsarecalculated.Thevalueisrestrictedby1/2oftheerrorthatexternalqualityassesentallows(ALB+10%)byCLIA’88asthemethodparisonresultsystemerror,andthenitisbiasassessed.ResultsTheresultsofparisonbetweendry-slidebromocresolgreenmethodandturbidimetricimmunoassaymethodareaollows:r2等于0.934,whenmedicaldecisionsare20g/L,35g/Land52g/L,theexpectedrelativedeviationsofdry-slidebromocresolgreenmethodare10.4%,6.8%,3.2%respectively.WhenXc等于20g/LandXc等于35g/L,therearesignificantdifferencesbetweentheresultsoftwomethods.ConclusionTurbidimetricimmunoassayisregardedasthemethodologyinparison.Dry-slidebromocresolgreenmethod,however,provespositivedeviationsintheresultsofALBdetermination.ItsvalueofbiasincreaseswiththedeclineofALBconcentration,anditioreapparentwhentheconcentrationturnslow.Thesetwomethodshepoorcorrelation.Therefore,whendifferentanalysiethodsareutilizedinthedetectionofthesameobject,itissuggesteddifferentmethodologicalparisonsandbiasassesentsbeusedineachmethodtomakeclearthedisparitiesamongthemandthenestablisheachreferencerange,especiallytheconcentrationreferencevaluesofdifferentmethodsindifferentmedicaldecisions,toinsuretheparabilityofthedetectionresults.

【Keywords】(ALB)serumalbumin,Turbidimetricimmunoassaymethod,Dry-slidebromocresolgreenmethod,Bias

作者单位:510080中山大学附属第一医院检验医学部

血清白蛋白测定是医院常规的生化检验项目,可作为诊断某些疾病(肾病综合征,肝硬化等)和评估预后的指标,其值的高低也可作为血液透析,肾移植患者生存期等的预测指标[2].是一种非特异性的,具有预后价值的标志物.

目前测定白蛋白的方法有电泳法,免疫法和染料结合法.不同的方法测定ALB的结果存在一定的差异,在某些疾病的患者(肾衰竭),不同方法的测定结果可以存在较明显的偏倚[2],特别是在低浓度时尤为显著.其差异将对临床的诊疗观察和疗效预后带来误导,因此,血清ALB测定的准确性对临床医疗的意义十分重大.本文依据NCCLS标准化文件的EP9-A2,对干化学法及免疫透射比浊法测定ALB的结果进行方法学比较及偏倚评估.

1材料和方法

1.1材料

1.1.1仪器由日本Hitachi公司提供的Hitachi7170A全自动生化分析仪,美国强生公司提供的Vitros950生化分析仪.

1.1.2试剂材料Hitachi7170A免疫透射比浊法白蛋白试剂,质控品,定标液由基恩科技有限公司提供,批号分别为2364301,2322901,2323101.Vitros950白蛋白试剂,定标液均由美国强生公司提供,批号分别为0935-2097,KiT40456,质控品是英国RANDOX公司提供的AssayedhumanseralevelⅠ和levelⅡ质控品,批号分别为482UN,292UE/2.

1.1.3标本标本来自中山大学附属第一医院,选取健康人群或患者新鲜血清标本40份,无明显溶血,黄疸,脂浊,标本的浓度分布范围为ALB<30g/L(4份),30~40g/L(16份),41~50g/L(16份),ALB>50g/L(4份).

1.2方法

1.2.1测定方法免疫透射比浊法在Hitachi7170A上测定,干化学法(BCG法)在Vitros950上测定.

1.2.2方法对比实验依据EP9-A2文件,每天随机选取8份标本,先对标本进行随机排序,按1-8编号,每份标本分别用免疫透射比浊法,干化学法进行双份测定,先按1-8的顺序测定第一次,再按8-1的顺序测定第二次,连续测定5d,记录数据.测定结果以免疫透射比浊法为比较方法进行比较及偏倚评估.

1.2.3结果绘图

实验数据绘制四张图:①Yi对Xi的散点图(图1)②Yij对Xi的散点图(图2)③(Yi-Xi)对(Yi+Xi)/2的偏差图(图3)④(Yij+Xi)/2对(Yi+Xi)/2的偏差图(图4).

1.2.4判断离群点40个数据中只允许排除一个离群点,若离群点多于一个,则需增加8个实验数据.

1.2.4.1目测线性及离群点

1.2.4.2方法内离群点的检查计算样本双份测定的差值绝对值的平均值(DX和DY)及样本双份测定的标准化差值绝对值的平均值(DX’和DY’),若Xi1-Xi2,Yi1-Yi2分别超过4DX,4DY界限且DX’,DY’分别超过4DX’,4DY’则视为离群点.

1.2.4.3方法间离群点的检查

计算方法间测定的绝对差值的平均值(E)及方法间标准化绝对差值的平均值(E’),若Eij,E’ij分别超过4E,4E’则视为离群点.

1.2.5线性回归分析及偏倚评估

计算线性方程及相关系数,根据线性方程计算给定医学决定水平(Xc)的预期偏倚及95%的可信范围.若r2<0.950,且X的取值范围不能再扩展,则采用分部偏倚法代替线性回归分析法评估偏倚.以CLIA’88规定的室间质评(ALB+10%)允许误差的1/2作为方法比较结果系统误差的允许限值(E?A)[4],计算出给定医学决定水平处的允许误差,以医学决定水平处的系统误差来判断各方法是否可以接受[4,5,7],将预期偏差的可信区间与给定医学决定水平处的EA相比较:①EA>预期偏差可信区间的上限(预期偏差可信区间的上、下限为负值时,取其绝对值进行比较),预期偏差小于可接受偏差的概率很高(>97.5%),试验方法与对比方法相当,可以接受,②预期偏差的可信区间的上限>EA>预期偏差的可信区间的下限,则数据未显示试验方法的偏差有别于可接受偏差,试验方法与对比方法相当,③EA<预期偏差可信区间的下限,预期偏差大于可接受偏差的概率很高(>97.5%),试验方法与对比方法不相当,不能被接受.

2结果

2.1两种方法测定结果见表1,绘制散点图及偏差图:见图1～4.

表1

免疫透射比浊法与干化学法测定ALB结果

干化学法(Y)免疫透射比浊学(X)

Y1Y2Y1-Y2YiX1X2X1-X2Xi

120.420.50.120.4519.619.10.519.35

234.334.3034.331.331.90.631.6

337.838.30.538.0532.733.30.633

436.836.90.136.8531.231.10.131.15

等

1240.841.70.941.2537.537.20.337.35

等

3947.747.20.547.4545.445.4045.4

4050.9510.150.955352.10.952.55

图1免疫透射比浊法与干化学法双份测定均值的散点图

图2免疫透射比浊法双份测定均值对干化学法所有结果的散点图

图3免疫法与干化学测定均值之差对两方法重复测定均值的偏差图

图4免疫透射比浊法与干化学法(Yij+Xi)/2-(Yi+Xi)/2偏差图

2.2按照EP9-A2文件进行方法内及方法间离群点检查,40份数据未发现有离群点.计算得到干化学法与免疫透射比浊法的r2等于0.934<0.950,由于X的取值范围足够宽,因此采用分部偏倚评估方法,计算得到干化学法对比免疫透射比浊法,在医学决定水平20g/L,35g/L,52g/L时,干化学法的预期偏倚分别为2.08,2.04,1.64,95%可信限分别为(1.30,2.87)、(1.85,2.33)、(1.18,1.93),在Xc=20g/L及Xc=35g/L时EA

表2

干化学法在给定医学决定水平的预期偏差及可信限

免疫透射比浊法(g/L)1/2Xc允许误差(g/L)干化学法(g/L)预期偏倚(g/L)Bc95%可信限

下限上限

相对偏倚(%)

20±122.082.081.302.8710.4

35±1.7537.042.041.852.236.8

52±2.653.641.641.172.113.2

3讨论

目前白蛋白的测定方法,在临床实验室应用最广泛的常规方法是BCG染料结合法,染料结合法易受反应液pH、ALB与染料结合的密切程度及球蛋白的非特异干扰,导致测定结果偏高.在BCG法基础上发展的干片BCG法因其简便快速,微量敏感,抗干扰能力强,近年逐渐应用于临床急诊分析,但国外文献有报道,在威尔士室间质评(WEQAS)中,干片BCG法测定值存在负偏差[3].随着现代免疫分析技术的发展,高特异性、高灵敏度的免疫比浊法越来越多的应用于临床测定血清白蛋白,该方法易受标本本身浊度、抗血清质量的影响.

免疫法测定ALB,是基于抗原抗体的特异性反应进行检测的,从方法学上来讲是具有高度特异性的.因为ALB的测定缺乏可供对照的参考方法,所以本研究以免疫透射比浊法作为比较方法,依据NCCLS的标准化文件EP9-A2,对免疫透射比浊法及干化学法测定ALB结果的进行比较评价.通过数据的分析,表明干化学法测定ALBį

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干化学法测定ALB是在一个完整配套、统一的检测系统中进行,其所用的仪器、试剂、定标液、方法学、操作程序均是相配套且实行严格的标准化程序,方法可溯源至已核准的NISTSRM○R927c.但是,干化学法实质是BCG法,BCG法由于与球蛋白存在非特异性反应而使ALB测定结果偏高,虽然通过缩短反应时间可以有效减少干扰.但有研究表明在α2球蛋白含量较高,尤其当A/G<0.8时仍存在较明显的干扰[6].

目前国际上还没有临床可接受性能的统一判断标准,CLIA’88室间质量评估允许误差指标是世界上影响最大的法定允许误差指标[4],是很多国家临床检验的最低质量指标,该指标可用于检测系统或检测方法分析性能的评估,以评价实验室内方法间检测结果的可接受性.因此,本研究以CLIA’88规定的室间质评(ALB+10%)允许误差的1/2作为方法比较结果系统误差的允许限值,通过方法间预期偏倚的计算,在Xc等于20g/L及Xc等于35g/L时,干化学法的预期偏差95%可信限的下限大于系统误差允许限值,表明干化学法对比免疫透射比浊法,预期偏差大于可接受偏差的概率很高(>97.5%),测定结果存在显著差异.但是,因为免疫透射比浊法不是参考方法,所以并不能判断ALB在此医学决定水平浓度时,干化学法的测定结果是否可以接受,也不能说明两种方法哪种更准确,只能说明两者在低浓度水平时测定结果差异较显著.

方法学比较实验是实现分析方法准确度溯源及检验结果可比性的一个重要途径.由于方法间的差异,实验室应该对不同检测方法建立相应的参考范围,特别是建立不同方法在不同医学决定水平浓度的参考值.当实验室内使用不同分析方法对同一分析物进行分析时,应该进行方法学比较及偏倚评估,明确各种方法存在的差异,以保证测定结果的可比性.