hTERTsiRNA对人肝癌细胞QGY增殖活性的影响

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【摘 要 】目的：利用siRNA在肝癌细胞内诱导RNAi,抑制hTERT基因表达,探讨RNAi对肝癌细胞增殖活性的影响.方法：构建靶向hTERT基因的siRNA（hTERT-siRNA）,转导入肝癌细胞株QGY,采用3H-TdR掺入法检测转染质粒后细胞增殖活性.结果：成功构建hTERT-siRNA,其对肝癌细胞增殖具有明显抑制效应,抑制率达42%.结论：hTERT-siRNA能明显抑制肝癌细胞的增殖.

【关 键 词 】RNAi；肝细胞癌；hTERT

文章编号：1009-5519（2008）23-3487-02 中图分类号：R73 文献标识码：A

原发性肝癌是严重威胁人类健康的一种疾病,我国已成为世界上肝癌发病最集中的国家,每年新发病例约占全球的45％.目前对肝癌的治疗方法主要有外科手术疗法、经皮酒精注射、动脉栓塞、化疗等,但总的效果并不太理想.基因治疗是当今研究的热点,探索与肝癌发生、发展相关的基因为治疗靶点成为关键.

已有研究发现,端粒酶的异常表达与恶性肿瘤的发生发展和预后密切相关[1].端粒酶逆转录酶(humantelomerase reverse transcriptase,hTERT)是代表端粒酶活性的非常重要的标志物,它的表达与端粒酶活性具有一致性,hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89．5％[2].研究表明hTERT的高表达能抑制细胞凋亡,导致细胞永生化[3].本实验依据RNA干扰(RNA interference,RNAi)原理,使用短发夹样RNA设计的RNAi-DNA载体方法,以hTERT基因为靶点,构建稳定表达小干扰RNA(all interfering RNA,siRNA)的肝癌QGY细胞株,探索hTERT siRNA对QGY细胞增殖活性的影响.

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：人肝癌QGY细胞株购自中科院上海细胞生物研究所.常规培养于含10%新生牛血清及青、链霉素的RPMI-1640培养液,37℃、5% CO2孵箱中培养.

1.1.2 质粒：质粒pGenesil-1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司.

1.1.3 试剂：限制性内切酶BamH1、Hind III和EcoRI购自Takara公司,总RNA提取试剂、转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；PCR试剂购自Takara公司；siRNA-hTERT转录模板由上海生工公司合成.

1.2 pGenesil- hTERT-siRNA质粒构建：shRNA发夹结构序列长度为65 bp,两端分别为BamH1、HindIII 酶切位点,中间为9 bp茎环序列分隔的反向重复靶序列,并以6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子.质粒构建采用BamH1、HindIII双酶切空质粒pGenesil-1,将shRNA-hTERT转录模板5'-AAGTGTCACAGCCTGTTTCTG-3'和阴性对照转录模板5'-AAGCTTCATAAGGCGCATAGC-3'（与人基因无同源性）分别设计成发夹结构,定向克隆至该载体上,经筛选、酶切鉴定后,进行测序确定,命名为pGenesil-A,阴性对照命名为pGenesil-B.

1.3 质粒转染：采用LipofectamineTM2000脂质体转染法.转染前1天,换取无抗生素培养液,按5×103/孔接种96孔板,置37 ℃培养.待细胞增至90%~95%时,将细胞分为两组,每组12孔,按1∶4的质粒-脂质体复合物分别进行转染质粒pGenesil- A和pGenesil-B至细胞中.培养24 h后换G418选择培养液,继续培养12h后进行3H-TdR掺入法实验.

1.4 3H-TdR掺入法检测转染质粒后细胞增殖活性：每孔加入3H-TdR 1μCi,继续培养12 h,PBS清洗、胰酶消化后,收集细胞至玻璃纤维滤纸.晾干后,加入装有闪烁液的闪烁瓶中用液体闪烁计数仪检测3H放射强度(cpm值).

1.5 统计学处理：cpm值以均数±标准差（x±s）表示,应用SPSS12.0软件包进行处理,两组组间差异比较采用t检验,P＜0.05被视为有统计学意义.

2.结果

2.1 重组质粒的鉴定：质粒pGenesil-A和pGenesil-B经Hind III和EcoR I双酶切,同时做pGenesil-1空载体双酶切对照.1%琼脂糖电泳,pGenesil-1空载体经双酶切后呈2条带,分别为4.54 kb的载体片段和364 bp的小片段；而重组质粒则为4.54 kb的载体片段和425 bp的目的片段.测序结果均正确.

2.2 细胞增殖活性检测：转染质粒pGenesil-A后QGY细胞的cpm值为56389±6243,转染阴性对照质粒pGenesil-B后QGY细胞的cpm值为98674±5418.与阴性对照质粒pGenesil-B比较,质粒pGenesil-A转染QGY细胞48h能够明显抑制肿瘤细胞增殖（P＜0.01）,抑制率达42％.证实hTERT的siRNA在体外抑制hTERT表达后,能抑制肿瘤细胞增殖,见图1.

3.讨论

端粒酶是一种核糖核蛋白酶,由RNA和蛋白质组成,具有逆转录酶的功能,能以自身的RNA为模板合成端粒DNA,从而维持端粒的长度.在正常人体细胞,端粒随细胞分裂而进行性缩短,当达到一定程度,细胞就衰老死亡.端粒酶的激活可使端粒长度保持相对稳定,从而使细胞获得永生化,进一步发生癌变,提示端粒酶的激活与恶性肿瘤发生、发展密切相关[4].而端粒酶催化亚基 (hTERT)是端粒酶全酶活性的限速因素,与肝癌关系更为密切,hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89．5％ .特异性地抑制hTERT基因在肝癌细胞中的表达,有望成为新的肝癌基因治疗靶点.

RNA干扰技术发展迅速,现已成为分子生物学研究的主要手段之一,已有众多研究探索其对肿瘤治疗的可行性[5].本实验利用RNAi-DNA载体技术,以hTERT基因为靶点,成功构建hTERT基因的小干扰RNA,并首先研究hTERT siRNA对肝癌细胞QGY的增殖活性的影响.结果表明siRNA能显著抑制肝癌细胞QGY的增殖,抑制率达42％,提示hTERT与肝癌发生、发展关系密切.进一步探索以hTERT为靶点的基因治疗,将为肝癌基因治疗的临床应用开辟新的思路.