TNHLTCRγ多重引物基因重排PCR参数优化

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【摘 要 】目的优化PCR多个参数分析固定石蜡包埋标本中T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)的TCRγ多重引物基因重排,以建立PCR扩增中不同变量性能改变的重要意义.方法优化PCR循环参数,采用优化的PCR方法检测53例T-NHL的TCRγ基因重排率.结果53例T-NHL中,采用优化的TCRγ多重引物克隆性TCRγ基因重排检测率为623%.结论实验性的调整PCR参数对FFPE组织的克隆分析,可能会有很大的价值.【关 键 词 】T-NHLTCRγ基因重排PCR

The optimizations of PCR parameter of TCRγ multiple primer gene rearrangement in T-NHLDU Shan-mei,ZHOU Ren,LIU Kui. Shandong Wanjie Medical University,Zibo 255213,China【Abstract】ObjectiveTo optimize multi-parameter of PCR,and analyzed TCRγ gene rearrangement on formalin fixed and paraffin embedded(FFPE)samples in T-NHL,in order to establish the significance of different variables on performance of PCR amplification.MethodsTo change PCR cycle parameters,detecte the rate of the cloning TCRγ gene rearrangement in 53 cases of T-NHL by Using our improved protocol of PCR.ResultsUsing our improved protocol of the TCRγ multi-primers,the detection rate of the cloning TCRγ gene rearrangement in 53 cases of T-NHL was 623%.ConclusionIt may be of great value to adjust PCR parameters by experiment for the Cloning analysis of FFPE tissue.【Key words】T-NHL,TCRγ gene rearrangement,PCR以PCR为基础的克隆分析虽不是一项新颖的方法,但现有发表的文章很少有改变PCR参数扩增固定石蜡包埋(FFPE)样本的DNA模板的研究分析.本实验以FFPE组织中TCRγ基因重排为研究对象,选用TCR多重引物,通过优化PCR多个参数分析T-NHL中TCRγ基因重排,以建立PCR扩增中不同变量性能改变的重要意义.1资料与方法


11一般资料收集1997~2008年浙江大学医学院附属医院及浙江省内其它医院的T-NHL标本53例.全部标本经中性固定、常规石蜡包埋.

12方法

121随机选取6例T-NHL,常规蛋白酶K-酚氯仿法抽提DNA.

122PCR(1)引物由上海生物工程公司合成.引物序列参照文献[1].分为TCRγA管:Vγ1f+Vγ10+Jp1/2+Jγ1/2和TCRγB管:Vγ9+Vγ11+Jp1/2+Jγ1/2共2个多重PCR反应.PCR产物长度在80~220 bp.(2)PCR体系与循环参数:①按照标准的PCR反应体系与循环参数设置不同的变量(见表1).②退火温度范围确定:选取反应体系各成分浓度的常用值.总体积25 μL:10×buffer 25 μL,MgCl2 15 μL(终浓度15 mM),dNTPs 5 μL(终浓度150 μM),引物各02 μL(浓度50 pM),TaqPlus酶02 μL(1U),模板DNA 2 μL,体积不足部分双蒸水补足.反应条件:95 ℃预变性7 min循环条件:95 ℃变性1 min,退火温度509 ℃~655 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 1 min,38个循环反应结束后在72 ℃延伸10 min.PCR反应在可以设定梯度退火温度的Eppendorf梯度PCR仪上进行,共有12个不同的温度.(3)对照:jurkat细胞做阳性对照反应性增生淋巴结作为阴性对照双蒸水取代样本模板DNA为空白对照.

123(1)2%琼脂糖凝胶电泳:PCR产物5 μL+1 μL上样缓冲液进行电泳,然后用凝胶成像系统检测.目标位置处见一条或两条狭窄而致密的亮带判断为单克隆重排,未见条带或涂片样条带判断为多克隆重排.(2)8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳:按Biorad公司出品的垂直凝胶电泳装置的说明进行灌胶上样、电泳、银染.银染后凝胶见一条或两条条带判断为单克隆重排,未见条带或涂抹样条带判为多克隆.

124采用优化的TCRγ引物,检测53例T-NHL标本TCRγ克隆性重排.

2结果

21TCRγA,B管需40个循环,引物量50 pmol以上,Mg2+终浓度125~175 mM,dNTP终浓度100~200 μM,达到最佳扩增效果退货温度在509 ℃~655 ℃ TCRγA管都可达到满意的扩增效果,而TCRγB管则需在509 ℃~567 ℃.

表1TCRγ多重引物PCR扩增中不同变量循环数(个)35X38X40X45X引物[pmol/reaction]102550100MgCl2[mM/reaction]10125151752025dNTPs[μM/reaction]50100200300400注:数据没有对应关系,都为变量

22采用优化的TCRγ多重引物克隆性TCRγ基因重排检测率为623%(33/53).3讨论FFPE是最广泛的可获得的用于回顾性研究的材料.但是,众所周知,引起的核酸与蛋白质间的交联,以及甲醛转化而成的亚甲醇结合到间基上引起的DNA的共价修饰,使得固定的组织样本中分离出的DNA常成高度降解状态,不利于PCR扩增[2].因此,如何提高FFPE组织中DNA的检测能力是一个需要解决的问题.影响PCR实验效果的因数很多,通过循环数目增加来改善PCR循环参数,是最简单的方法.退火温度是影响PCR扩增效果的关键因数之一,在常规PCR条件下,退火温度在一定范围内都可以得到相应的扩增产物.影响PCR扩增效果的因数还有引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度等.实验显示:与细胞相比,引物浓度对FFPE组织的DNA的影响较大,原因可能是固定所致蛋白-DNA交联,DNA链断裂和DNA序列改变,可能会产生随机寡核苷酸的核酸碎片.这些小的核碎片达不到足以有效的扩增长度,但可与模板竞争引物而可能会抑制特异性的PCR扩增.采用优化的TCRγPCR方法检测了53例T-NHL,检测率为623%.这一高的检测率与其它文献相比证明了优化方法的适用性[3].总体而言,研究结果表明,轻微增加引物浓度可以改善FFPE组织的TCRγ克隆性PCR检测.实验性的调整PCR参数对FFPE组织的克隆分析,可能会有很大的价值,通过PCR技术上的优化,有助于确定哪些参数以及如何应改变这些参数以尽量减少假阴性和假阳性结果.参 考 文 献

[1] Van Dongen , Langerak AW, Brüggemann M,et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene rebinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia,2003,17(12):2257-2317.

[2] Metz B, Kersten GF, Hoogerhout P, et al. Identification offormaldehyde-induced modifications in proteins. Reactions with model peptides. J Biol Chem,2004,279:6235-6243.

[3] Bagg A, Braziel RM, Arber DA, et al. Immunoglobulin hey chain gene analysis in lymphomas-A multi-center study demonstrating the heterogeneity of performance of polymerase chain reactions assays. J Mol Diag,2002, 4:81-89.

(收稿日期:2010-10-11)

(本文编辑:郎威)


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