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摘 要：重组PCR方法的发展为体外突变技术提供了更快捷、准确的方法.通过改进引物设计和PCR保真性等方法,应用重叠延伸PCR的原理成功地实现了对BA基因的定点突变,并构建了其含有m1,m2,m3和m4的突变体.实验证明通过这种改进方法可以有效地进行长片段基因的突变,并且这种方法与其他方法相比具有简便、快捷、经济、高效的特点.
关 键 词 ：定点突变；重叠延伸PCR(OE PCR)；基因
中图分类号：Q785
文献标识码：A
文章编号：1007―7847(2006)01―0034―05
体外定点突变技术是研究基因、蛋白质结构 和功能之间复杂关系的有力工具,也是实验室中 改造或优化基因常用的手段.缺失、插入或替换 特定碱基的定点突变可用不同的方法来实现.目 前已报道的以PCR为基础的各种诱变方法中, “重叠延伸法”和“大引物法”比较突出,在此 基础上发展的“一步PCR方法”也有一定的应用 范围.这些方法虽然都有各自的优点,但其诱变 率却不理想.
本研究中突变的基因(BA)长度较大(3,0 kb),我们拟将它的4个丝氨酸(Ser)位点(m1, m2,m3和m4)通过碱基置换变为编码丙氨酸 (AIa)的位点,预突变的位置都位于基因中后段, 综合这些特点,本研究通过改进引物设计和PCR 保真性等方法应用重叠延伸PCR(overlap exten- sionPCR,OEPCR)原理实现了对BA基因的定点 突变并构建了突变体.实验证明了此种改良方法 简便、快捷、经济而又突变准确,尤其适用于长片 段基因的定点突变.
1.材料和方法
1．1 材料
T4DNA连接酶购自NEB公司,T4DNA聚合 酶,限制性内切酶KpnI、XhoI与dNTPs及凝胶 纯化回收试剂盒(DV805A)均购自TaKaRa公司, 引物合成于TaKaRa公司,PfuUltraTMDNA高保真 聚合酶购自Stratagene公司,pOTB7-BA质粒, 克隆载体pcDNA3,1 HisA购自lnvitrogen公司.
1．2 方法
自行设计的在BA基因开放阅读框两端的引 物Pa／Pb,通过分别引入限制性酶切位点KPnI 和Xho I可将其导人载体pcDNA 3．1 HisA．引 物如下：
OEPCR分为三轮,第一轮以质粒pOTB7―BA 为模板利用引物Pa即BA基因开放阅读框外侧 5,上游引物与突变点3’下游引物PmR(mutation reverseprimer)(PmlR,Pm2R,Pm3R或Pm4R),第 二轮仍以质粒pOTB7-BA为模板利用引物Pb即 BA基因开放阅读框外侧3’下游引物与突变点5’ 上游引物PmF(mutation forward primer)(PmlF, Pm2F,Pm3F或Pm4F).第一、二轮的PCR产物经 纯化回收后以摩尔比1：1为模板利用引物Pa／Pb 进行第三轮的重叠延伸PCR,变性后的PaPmR和 PbPmF段在重叠区域退火,进行延伸形成全长的突 变双链DNA.因第一、二轮的PCR产物在拟突变点 左右有重叠,故此称为重叠延伸PCR(见图1).
突变引物PmlF／PmlR,Pm2F／Pm2R,Pm3F／ Pm3R,Pm4F／Pm4R分别设计在这4个拟突变位 点的两侧,并且每对引物之间有一定的重叠碱基, 重叠的碱基数都在2t bp以上(见表1).
PCR反应体系如下：在每个PCR体系中,模板 20ng,dNTPs0．2mmol／L,镁离子1．5mmol／L,每 种引物10μmol／L,PfuUltraTMDNA高保真聚合酶 0．025 U,对于所有的PCR反应,均是94℃预变 性3 min,执行下述30个循环之后,72℃延伸10 rain,4℃保存.PCR反应条件见表2,
直接用引物Pa与Pb扩增出BA野生型(BA wildtype,BAwt)转入载体作为试验的对照.BA wt和4个不同突变体的PCR产物经琼脂糖电泳、 纯化回收及双酶切(kpI和XhoI)与双酶切载 体pcDNA3．1 HisA(KpnI和Xh01)连接,4℃连 接过夜,转化人大肠杆菌DH5a.采用含氨苄青霉 素(50mg／L)的LB平板筛选白斑,酶切鉴定筛选 阳性克隆.
1.3 测序
核苷酸序列的测定采用Sanger双脱氧末端 中止法,在ABl373ADNA序列测定仪上测序,此 项工作由上海生工测序部完成.
2.结果
对于这4个突变体,每一轮PCR扩增出的产 物都可见清晰的特异性条带,片段大小都与预期 的理论值相符(图2、3、4)
对于重组质粒BA－pcDNA 3．1 His A进行酶 切鉴定,结果都与预期的理论值相符,表明上、下 游片段连接正确.
测序分析对突变点进行了准确地分析,并与 引物pa与Pb扩增出的BA野生型的测序结果作 比较,结果表明,这4种不同的突变体ml,m2,m3 和m4的Ser位点被准确的突变为Ala(图5、6、7、 8),并且无其他的突变发生．提交的克隆经测序 被100％的证实进行了准确的预定突变.
3.讨论
综上所述,我们采用此方法对BA长片段基 因进行定点突变,其结果表明此方法具有准确的 诱变率,实用性强,使用的试剂少、费用低等特点． 由于BA基因的片段长度较大(3．0kb),而且拟 突变的位点位于基因5’方向2／3处,离5’端2kb 或者3,端1 kb,距离都较远,这就决定了在对该基 因进行突变过程中应该注意如下几个问题：
1)确保预定突变的诱变成功率；2)保证长片 段基因除突变位点以外部分的扩增准确性；3)避 免作为PCR模板的野生型质粒带人的微量污染 而导致的阴性结果.
因此在本实验中我们采取了如下措施以避免 上述问题.首先,在引物的设计方面,通常在拟突 变位点的两侧设计的一对引物之间有一定的重叠 碱基,大概在15bp左右,引物的长度在15～18 bp左右.我们在设计引物的时候考虑到长片段 基因的特点将突变引物的长度设计在22 bp左 右,提高了引物与模板结合的特异性.另外每对 突变引物的重叠碱基均在21 bp以上,保证了上、 下游(PaPmR和PbPmF)(见图1)片段的双重突变 重叠区域的长度,提高了突变的成功率.本研究 曾采用长度18bp,重叠碱基15 bp的一对引物, 结果经测序鉴定没有实现定点突变,其次,在突 变点诱变成功基础上,保持这样长片段基因除突 变碱基以外其它部分的准确才可为后续试验奠定 可靠的基础,所以我们采用了高可信度的PfuUltra DNAPolymerase,PfuUltrTM高保真DNA聚合酶的 平均错配率为普通PfuDNA聚合酶的三分之一, 为TaqDNA聚合酶的十八分之一.它是目前保 真度最高的PCR酶.该酶添加ArchaeMaxx聚合 酶增强因子,显著提高产量、减少扩增时间并可扩 增更长的模板,确保了扩增准确性,另外,我们在 前两轮的PCR结束后都对扩增产物进行琼脂糖 凝胶电泳后,切胶纯化回收作为下一轮扩增的模 板,避免了作为PCR模板的野生型质粒带入的污 染或者是模板质粒纯化时所带的细菌染色体 DNA污染.
在本实验中,我们利用上述改良步骤获得了 正确的突变体克隆,目前国内报道的利用重叠延 伸法进行突变的最大的基因为2．4kb,我们得 到了3．0kb的定点突变基因,突变点位于片段 2／3处,证实大片段基因的改造完全可以利用这 种方法实现；而且这个方法所进行的三轮PCR在 1―2d内就可以完成,既快捷又准确.
对于长片段基因的体外定点突变,本试验提 供了一种简便、准确、经济而又切实可行的方法.
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