中药含药血清对MRSAβ内酰胺类抗生素耐药性mecA\femA基因的影响

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【摘 要】 目的：研究中药在体内对MRSAβ-内酰胺类抗生素耐药性的影响.方法：采用中药含药血清与MRSA共同培养的方法进行耐药性逆转实验,用K-B纸片扩散法观察实验前后受试菌抑菌环直径的变化,同时进行耐药基因mecA、femA的检测.结果：对照组与实验组K-B纸片扩散法对比,五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝组对苯唑西林钠、头孢唑啉钠、头孢呋辛、头孢噻肟钠、头孢美唑等药物抑菌环直径扩大均有不同程度扩大,由耐药或中敏恢复为敏感；对青霉素抑菌环直径无影响,仍表现为耐药.MRSA标准菌株、对照组菌株均检测出耐药特异性基因mecA、femA,丹皮、五倍子、防风、黄芩、浙贝、绿茶组未测出femA基因, mecA基因条带显示明显减弱.结论：MRSA经五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝含药血清处理后均恢复了对耐酶β-内酰胺类抗生素的敏感性,且耐药基因mecA、femA的表达明显受抑制,推测其可能通过作用于mecA、femA或其调控因素,影响耐药基因的表达程度, 使PBP2a产生减少或消除,从而达到耐药性逆转的作用.

【关 键 词 】 中药；MRSA；β-内酰胺；耐药；基因

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistant staphyloc occus aureus,MRSA)是医院感染的重要病原菌之一.自1961年英国的Jevons首次报道MRSA感染以来,其发生率在全球范围内迅速增加,耐药程度不断加深.对于MRSA的治疗方法,虽然在新药研制与联合用药等方面有一些进展,但万古霉素仍然是临床首选药物.随着对万古霉素中敏或耐药金黄色葡萄球菌菌株（VISA/VRSA）的出现[1],对抗生素的选择余地已越来越小,因而一部分学者将目光转移到耐药性逆转药物的研究上.近年研究发现,部分中药与抗生素联合应用可增强对MRSA的治疗效果,并对其耐药质粒有消除作用.本研究选用五倍子、防风、丹皮等中药含药血清对MRSA进行耐药性逆转试验,以观察中药在体内对MRSAβ-内酰胺类抗生素耐药性的影响.

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 MRSA标准菌株(ATC3300)由卫生部临床检验中心惠赠,MRSA临床分离菌株由沈阳军区医学检验中心提供（K-B纸片扩散法苯唑西林抑菌环直径≤10mm,头孢西丁≤19mm）.

1.1.2 中药 五倍子、防风、黄芩、浙贝、丹皮等14种中药购自辽宁中医学院第三附属医院药剂科.

1.1.3 动物 Wistar大鼠购自沈阳军区总医院动物实验科.

1.1.4 试剂 M-H培养基（BD公司）、抗生素药敏纸片（北京天坛药物生物技术开发公司）、DNA提取试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）、PCR引物（上海博亚生物技术有限公司）.

1.1.5 仪器 LIGHTCYCIER荧光定量PCR检测仪（罗氏公司）、DY-A电泳仪（上海生化所西巴斯生物技术开发公司）.

2.方法

2.1 中药煎剂制备 每味中药各100g,参考文献[2]方法分别煎煮至100ml药液.

2.2 含药血清制备 Wistar大鼠60只,♂♀各半,体重200±20g,每4只分为1组,共15组.对照组灌服生理盐水,实验组分别灌服单味中药煎剂(相当于生药5g/kg),2次/日,共5日.末次给药2小时后眶内采血,无菌分离血清,将各组4只大鼠的血清混合备用.

2.3 耐药性逆转试验 各组取4ml含药血清加入5mlM-H肉汤中,37℃培养48h,取50μl培养物进行药敏试验, 选用苯唑西林钠、青霉素、头孢唑啉钠、头孢噻肟钠、头孢呋辛、头孢美唑等抗生素药敏纸片,采用WHO推荐的K-B纸片扩散法,观察对照组与实验组抑菌环大小的差异,以筛选出在体内对MRSA有逆转作用的单味中药.

2.4 耐药基因检测

2.4.1 模板DNA制备 各组取4ml含药血清加入5mlM-H肉汤中,37℃培养48h,划线法接种于M-H培养皿,37℃培养24h, 挑取单个MRSA菌落至10mlM-H液体培养基中37℃振荡过夜,离心收集细菌.DNA提取过程按试剂盒说明进行.

2.4.2 PCR扩增 参考文献[3]方法.mecA基因引物P1:5′TGGCTATCGTGTCACAATCG 3′,P2:5′CTGGAACTT GTTGA GCAGAG 3′,产物长310bp；femA基因引物P1：5′CTTACTT ACTGGCTGTACCTG3′,P2:5′ATGTCGCTTGTTATGTGC3′,产物长686bp.扩增总体积为25μl,其中包括:10×PCR缓冲液2.5μl、10mM4×ｄNTP2.5μl、15mMMgcl21.5μl、引物各1.25μl （50pmol/L）、DNA模板2.5μl、TapDNA酶0.1μl（1Ｕ）及无菌蒸馏水10.9μl.以无菌石蜡油30μl覆盖液面,于92℃预变性3min,92℃60ｓ、56℃60ｓ、72℃60ｓ,共30个循环,最后于72℃延伸3min.

2.4.3 扩增产物的鉴定 取扩增产物10μl,进行1%琼脂糖凝胶(含EB)电泳(110V、30 min),于紫外灯下观察结果并照相.

3.结果

3.1 逆转试验 对照组与实验组K-B纸片扩散法对比,五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝组对苯唑西林钠抑菌环直径扩大8-12mm,对头孢唑啉钠抑菌环直径扩大2-8mm,头孢呋辛抑菌环直径扩大2-14mm,头孢噻肟钠抑菌环直径扩大6-16mm,头孢美唑抑菌环直径扩大4-6mm,均由耐药或中敏恢复为敏感；对青霉素抑菌环直径无影响,仍表现为耐药.见下表.

纸片扩散法抑菌环直径（mm）

R S 对照组 黄芩组 浙贝组 丹皮组 防风组 绿茶组 五倍子组

苯唑西林钠 ≤10 ≥13 6 16 14 18 16 18 14

青霉素 ≤28 ≥29 10 10 10 10 10 10 10

头孢唑啉钠 ≤14 ≥18 16 22 18 18 18 18 24

头孢呋辛 ≤14 ≥18 18 20 20 24 32 26 22

头孢噻肟钠 ≤14 ≥23 14 20 20 20 30 28 20

头孢美唑 ≤12 ≥16 12 16 16 18 16 16 16

3.2 mecA、femA基因检测 MRSA标准菌株、对照组菌株均检测出耐药特异性基因mecA、femA,丹皮、五倍子、防风、黄芩、浙贝、绿茶组未测出femA基因, mecA基因条带显示明显减弱.见下图.

a b c d e f g h i j k l m n o p q

a.Marker；b.MRSA质控菌株；c.对照组； d.丹皮；e.白果；f.赤芍；g.川芎；h.五倍子；i.防风j.蝉蜕；k.知母；l.白术；m.黄连；n.丹参；o.黄芩；p.浙贝； q.绿茶

4.讨论

敏感金黄色葡萄球菌有4种青霉素结合蛋白PBPs,即PBP1、2、3和4,它们具有合成细菌细胞壁的功能.β-内酰胺类抗生素通过与细菌内膜上PBPs结合,抑制转肽酶的转肽作用,干扰细菌细胞壁的生物合成,导致细菌溶菌死亡,从而达抗菌作用.MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要有两种：一是可产生β-内酰胺酶,分解β-内酰胺类抗生素, PBPs可正常行使功能,细菌继续生长.二是由mecA基因介导产生了PBP2a蛋白,这种MRSA所特有的PBP2a不但与β-内酰胺类抗生素的亲和力极低,而且具有其他高亲和力PBPs的功能,当其他PBPs被β-内酰胺类抗生素抑制而不能发挥作用时,PBP2a可替代它们完成细菌细胞壁的合成,从而使细菌得以生存.除mecA外,其它辅助基因也参与了MRSA耐药性的形成,其中femA就是表达完整耐药性不可或缺的重要的一种辅助基因.近年的研究表明一些中药制剂或中药提取物与抗生素合用可明显增强抗菌活性.楠田美和子等的研究结果显示茶叶中的表没食子儿茶酸酯(EGCG)具有抑制MRSA对抗生素耐受性的作用[4],国内也有研究观察到双黄连与抗生素合用可明显破坏金黄色葡

萄球菌细胞壁结构[5],还有实验表明中药可消除金黄色葡萄球菌抗生素耐药质粒[6、7].但以上结果大多为体外实验,对于中药在体内对MRSA的耐药性有无影响并未做进一步的验证.本研究中MRSA经五倍子、绿茶、防风、丹皮、黄芩、浙贝含药血清处理后均恢复了对耐酶β-内酰胺类抗生素的敏感性,且耐药基因mecA、femA的表达明显受抑制,推测其可能通过作用于mecA、femA或其调控因素,影响耐药基因的表达程度, 使PBP2a产生减少或消除,从而达到耐药性逆转的作用.但上述中药可能对β-内酰胺酶的产生无影响,因而处理后的MRSA对青霉素仍然耐药.由于中药成分和在体内的代谢途径比较复杂,其实现耐药性逆转的有效成分和具体机制仍有待于进一步研究.