PON1基因多态性与原发性肝癌的相关性

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【摘 要 】目的 检测原发性肝癌病人与正常人PON1基因的多态性.方法 对121例原发性肝癌病人和100正常人运用SnapShot 技术检测PON1基因（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）这5个位点的表达.结果 原发性肝癌病人与正常人的PON1基因（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）这5位点的表达P>0.05.结论 PON1基因多态性与原发性肝癌无一定的相关性

【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）02-0107-02

原发性肝癌（HCC,以下简称肝癌）是临床上最常见的恶性肿瘤之一,全球发病率逐年增长,已超过65万/年, 居于恶性肿瘤的第5位； 死亡接近62.3万/年,位居肿瘤相关死亡的第3位.HCC在我国高发,目前,我国发病人数约占全球的56%；在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌,位居第二.因此,肝癌严重威胁我国人民健康和生命.目前已证实PON1基因M和Q等位基因的出现频率和乳腺癌发病风险呈正相关,同时表现为MM型和型基因的个体更易诱发乳腺癌（参考文献1）、另有实验证明检测血清PONI的活性可以作为肺癌患者与前列腺癌患者的辅助检查项目之一（参考文献6）、也有报道显示PON1基因与2型糖尿病的发生有关（参考文献7）.而关于肝癌的研究甚少,本实验运用SnapShot 技术深入研究PON1基因多态性（rs854552、rs662、rs757158、、rs854573、rs705382）与原发性肝癌发生的相关性.

1.材料与方法

1.1 研究对象

本实验选取 2008 年至2012 年在浙江大学附属第一医院肝胆胰中心住院的手术患者,经实验室及影像学等检查,临床诊断为原发性肝癌,行原发性肝癌根治手术,所有患者皆经术后病理明确诊断为肝细胞癌,121例原发性肝细胞肝癌病人的外周血标本,其中男性73 名,女性48名,年龄28岁至71岁,平均45.3岁,HBsAg阳性115例,阴性6例；AFP阳性87例,阴性34例.对照组100例均来自2010年3月～2012年4月间,在浙江大学附属第一医院采集的体检正常人静脉血样.体检结果均正常,无肝硬化、乙肝相关病史、糖尿病等疾病,且一级亲属无HCC病史.其中男性56 名,女性44名,年龄21岁至69岁,平均39.4岁,HBsAg,AFP均阴性.研究对象均有完整的临床资料,均签署知情同意书.

1.2 DNA提取

运用Promega maxwell@16机器提取DNA,大约40 分钟后,提取DNA 程序完成.将收集管中大约210μl 的DNA 溶液转移至冻存管.冻存管在-80℃冰箱保存

1.3 PON1基因的多态性分析

运用SnapShot 技术进行PON1基因的多态性分析.

1.3.1 PCR反应体系及反应条件 反应体系：（20μl）包含1x HotStarTaq buffer, 3.0 mM Mg2+, 0.3 mM dNTP, 1 U HotStarTaq polymerase （Qiagen Inc.） 和 1 l 样本DNA. 反应条件：95C 2min； 11 cycles x （94C 20s, 65C-0.5C /cycle 40 s, 72 C 1min30s）； 24cycles x （94C 20s, 59C 30s, 72 C 1min30s）； 72C 2 min； 4 C for ever

1.3.2 PCR产物纯化 在15μl PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶,37 C温浴1小时, 然后75C灭活15分钟

1.3.3 SNaPshot多重单碱基延伸反应

1.3.4 延伸产物上ABI3730XL测序仪 取0.5μl 纯化后的延伸产物,与0.5μl Liz120 SIZE STANDARD, 9μl Hi-Di 混匀, 95 C变性5分钟后上ABI3730XL测序仪,收集的原始数据用 GeneMapper 4.1 （AppliedBiosystems Co., Ltd., USA） 来分析.

1.4 结果

实验结果数据显示PON1基因多态性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382）,他们的位点等位基因频率比较差异无统计学意义（P>0.05）.经这些位点的共性,特性分层后分析差异扔无统计学意义（P>0.05）（表1）（表2）（表3）（表4）（表5）

1.5 讨论

对氧磷脂酶（paraoxonase,PON）是一类芳香酯酶,它能催化磷酸脂键水解,降解有机磷酸芳香羧基脂及氨基甲酸脂等.PON基因家族至少有3个成员即PON1、PON2、PON3,PON1基因位于人类第7号染色体短臂7q21-22,含9个外显子和8个内含子,具有多种多态性.目前发现人体内PON1活性与动脉粥样硬化、肝脏炎性疾病在内的很多疾病密切相关.血清PON1活性的降低数值可作为慢性肝炎和肝硬化患者肝脏损伤程度的指征.实验证明,体内PON1通过与HDL结合发挥强大的抗氧化功能,通过降低肝组织的氧化压力,阻止肝脏脂质过氧化等机制缓解肝脏纤维化的进程,降低肝损伤的程度（参考文献2）.

目前已有文献报道PON1基因,M和Q等位基因的出现频率和乳腺癌发病风险呈正相关,对于PON1基因,M和Q等位基因的出现频率和乳腺癌发病风险呈正相关,同时表现为MM型和型基因的个体更易诱发乳腺癌.另有实验证明原发性肺癌患者血清中PON1活性显著降低 其灵敏度和特异性符合一般检验的要求,因此检测血清PONI的活性可以作为肺癌患者与前列腺癌患者的辅助检查项目之一,也有报道显示PON1基因与2型糖尿病的发生有关,而已经有报道证实2型糖尿病是原发性肝癌的独立危险因素之一,因此本次研究希望检测PON1基因的多态性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382）发现与原发性肝癌发生的相关性. 本研究尚未发现PON1基因多态性（rs854552、rs662、rs757158、rs854573、rs705382）与HCC发病有显著相关性,其中一个可能原因在于目前收集的病例数量偏少.由于实验中对照组基因频率的高低会直接影响最终统计学结果的判断,若对照组的基因频率低,则更加容易得到阳性结果.现阶段实验对照的病例数量偏少,可能会使预期实验目标产生一定的偏离.另一原因可能是没有检测PON1基因多态性全部的位点,以致一些可以与原发性肝癌相关的位点遗漏.所以今后在该课题的进一步研究中,不仅需要扩大样本的数量,还应该检测基因多态性的全部位点,从而使实验结果尽可能达到预期的目标.本研究的实验结果对于进一步研究肝癌发生的相关性有一定的参考意义.