本站原创本文是一篇生物制品论文范文,生物制品方面自考毕业论文开题报告,关于雪莲中绿原酸、芦丁、木犀草素含量的HPLC法测定相关学士学位论文范文。适合生物制品及芦丁及溶液方面的的大学硕士和本科毕业论文以及生物制品相关开题报告范文和职称论文写作参考文献资料下载。
摘要：建立测定雪莲（Saussureainvolucrata）中绿原酸、芦丁和木犀草素含量的方法,采用HPLC法,色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18（250mm×4.6mm,5μm）,乙腈-0.8%磷酸水溶液进行梯度洗脱,流速1.0mL/min,检测波长360nm,柱温30℃.绿原酸、芦丁、木犀草素的线性范围分别为0.081～0.408μg/mL、0.090～0.449μg/mL、0.045～0.224μg/mL,平均加样回收率分别为99.78%、99.89%、100.70%,其中绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高,木犀草素在苞叶雪莲中含量最高.
关 键 词：高效液相色谱法（HPLC）,雪莲（Saussureainvolucrata）,绿原酸,芦丁,木犀草素
中图分类号：R284.2,S567文献标识码：A文章编号：0439-8114（2015）02-0434-03
DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.02.045
DetermingChlorogenicAcid,RutinandLuteolininSaussureaInvolucrateofThreeVarietieswithHPLC
ZHANGHai-xia1,LUYong-chang2,WANGShu1
（1.CollegeofLifeScienceandChemistry,QinghaiUniversityforNationalities,Xining810007,China,
2.KeyLaboratoryofChemical,Qinghai-TibetPlateauPlantsResources,Xining810007,China）
Abstract：Toestablishamethodfordeterminingchlorogenicacid,rutinandluteolininSaussureainvolucrate,theAgilentEclipseXDB-C18（250mm×4.6mm,5μm）columnwasused.Themobilephasewasconsistedofacetonitrileand0.8%aqueousphosphoricacidwithgradientelution.Theflowratewas1.0mlmin-1andthedetectivewelengthwas360nm.Thecolumntemperaturewas30℃.Thepeakareasandconcentrationsofchlorogenicacid,rutinandluteolinhadgoodcorrelationintherangesof0.081～0.408μg/mL,0.090～0.449μg/mLand0.0448～0.224μg/mL,withtheeragerecoveryratesof99.78%,99.89%and100.70%,respectively.ThecontentsofchlorogenicacidandrutinwerethehighestinSaussureainvolucrata（Kar.etKir.）Sch.-Bip.Saussureaobov-allata（DC.）Edgewhadthemaximumcontentofluteolin.
Keywords：HPLC,Saussureainvolucrata（Kar.etKir.）Sch.-Bip.,chlorogenicacid,rutin,luteolin
雪莲（Saussureainvolucrata）又名雪荷花,为菊科（Asteraceae）凤毛菊属（Saussurea）植物,珍稀名贵中药材,常见的有苞叶雪莲、水母雪莲、天山雪莲、唐古特雪莲等,主要分布在2400m以上的高原寒带地区的青海、新疆、甘肃、四川、西藏等地.雪莲性温、微苦,祛风除湿,通筋活血,暖宫散瘀效果显著.此外,对风湿性疾病具有特殊效果,还具有抗炎镇痛、止血消肿之功效,使用安全,无明显的不良反应[1-3].药理研究显示芦丁、木犀草素和绿原酸为雪莲中的主要抗肿瘤抗癌有效成分[4-6].对于芦丁、木犀草素和绿原酸在雪莲中的含量同时分析测定尚未见报道.为有效控制雪莲药材质量,本试验采用微波提取法对雪莲中芦丁、木犀草素和绿原酸进行提取,采用高效液相色谱法对芦丁、木犀草素和绿原酸的含量进行了测定,并比较了不同种雪莲药材3种物质的含量差异.该方法快速、简便、准确、重复性好,为雪莲药材的进一步研究和综合开发利用提供参考.
1材料与方法
1.1材料与仪器
雪莲系2012年8月采自青海、新疆（经高原生物研究所胡凤祖副研究员鉴定）.
Agilent1200型高效液相色谱仪,包括G1311A四元输液泵,G1316A柱温箱,G1329A自动进样器,G1315A二级管阵列（DAD）检测器,Agilent1200色谱工作站.
1.2试验试剂
芦丁标准品（中国药品生物制品检定所,批号：100080-200707）、绿原酸标准品（中国药品生物制品检定所,批号：110753-200212）和木犀草素标准品（中国药品生物制品检定所,批号：111520-200504）,乙腈,甲醇为色谱纯,磷酸为分析纯,水为超纯水.1.3色谱条件
色谱柱采用AgilentEclipseXDB-C18柱（250mm×4.6mm,5μm）,流动相乙腈（A）-0.8%磷酸水溶液（B）,梯度洗脱（0～8min,10%～15%A,8～12min,15%～30%A,12～35min,30%～32%A）,检测波长360nm,流速为1.0mL/min,进样10μL,柱温30℃.
1.4溶液的配制
1.4.1标准品溶液制备分别精密称取绿原酸10.20mg、芦丁11.23mg、木犀草素5.60mg,置于50mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,配成质量浓度分别为204.0、224.6、112.0mg/L的标准品储备液.
1.4.2供试品溶液的制备精密称取雪莲药材粉末1.30g,置具塞锥形瓶中,精密加入纯甲醇40mL,超声波处理2h,冷却,再称定重量,用纯甲醇补足减失重量,0.45μm微孔滤膜过滤即得.
2结果与分析
2.1系统适应性试验
分别吸取标准品溶液和供试品溶液,按“1.3”的色谱条件,分别进样10μL,记录色谱图.结果表明在此色谱条件下,绿原酸、芦丁、木犀草素分离良好,分离度均大于1.5,且理论塔板数均不低于4000,结果见图1至图4.
2.2线性关系考察
精密吸取上述标准品储备液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,置于50mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度摇匀,配成系列质量浓度的标准品溶液.取10μL进样后记录峰面积,以质量浓度（μg/mL）为横坐标（X）,以峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线,得到绿原酸、芦丁、木犀草素的回归方程.
绿原酸：Y等于12316X+99.5（r等于0.9999）
芦丁：Y等于11276X+246.5（r等于0.9997）
木犀草素：Y等于22277X+20.8（r等于0.9995）
结果表明,绿原酸、芦丁、木犀草素分别在0.081～0.408、0.090～0.449、0.045～0.224μg/mL与峰面积线性关系良好.
2.3稳定性试验
用自动进样器依次对同一供试品溶液进样,在1、2、3d后分别进样10μL,以峰面积计算.结果表明,绿原酸的RSD为1.23%,芦丁的RSD为1.35%,木犀草素的RSD为1.30%,供试品溶液在3d内稳定.
2.4精密度试验
按“1.3”的色谱条件,绿原酸,芦丁和木犀草素的标准品溶液各进10μL,每种溶液测定6次,记录峰面积,绿原酸RSD为0.88%,芦丁RSD为1.18%,木犀草素RSD为1.22%,表明进样精密度良好.
2.5重复性试验
精密称取水母雪莲粗粉（过100目）6份,按“1.4.2”制备样品溶液,用“1.3”的色谱条件,进样分析,记录峰面积,绿原酸的RSD为0.89%（n等于6）,芦丁的RSD为0.89%（n等于6）,木犀草素的RSD为1.11%（n等于6）.
2.6加样回收试验
取已知绿原酸、芦丁和木犀草素含量的雪莲9份,分别在上述9份药材中加入绿原酸的标准品溶液（0.204mg/mL）、芦丁标准品溶液（0.225mg/mL）和木犀草素标准品溶液（0.112mg/mL）,按“1.4.2”制得供试品溶液,分别进样10μL,记录雪莲中绿原酸、芦丁和木犀草素的峰面积,计算含量,并计算回收率,结果见表1.
2.6样品测定
按“1.3”的色谱条件,分别精密称取3种雪莲药材粉末各1g,按上述方法测得绿原酸质量分数为0.1321%～0.1933%,平均为0.1607%（n等于8）,芦丁质量分数为0.1134%～0.2022%,平均为0.1712%（n等于8）,木犀草素质量分数为0.0204%～0.0582%,平均为0.0361（n等于8）,其中绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高,木犀草素在苞叶雪莲中含量最高（表2）.
3小结与讨论
雪莲中所含成分复杂,其理化性质相差较大,表现出较大的色谱行为差异.目前文献报道的多组分含量测定方法不甚理想,多有拖尾现象.考虑到绿原酸与芦丁2组分均具酸性,笔者通过调节流动相的pH,以抑制样品组分的解离,较好地改善了峰形[7].同时,三者的极性差异较大,为了使各组分有较好的分离效果,采用梯度洗脱技术[8,9].先后使用不同比例的甲醇、甲醇-磷酸、乙腈、乙腈-甲酸、乙腈-醋酸、乙腈-磷酸等,分离效果均不显著,分离度不达标,采用乙腈-0.8%磷酸水溶液梯度洗脱后,拖尾情况有较好改善,图谱特征性增强,目标峰的峰型和分离度均较好,故选择乙腈-0.8%磷酸水溶液为流动相[6],用于梯度洗脱.
通过对3种雪莲样品中3种药效化合物的含量进行测定,结果表明,不同种雪莲有效成分含量有差异：木犀草素在苞叶雪莲中含量最高,绿原酸、芦丁在天山雪莲中含量最高.可见,品种基因影响了药材有效成分的积累,根据有效成分的含量确定药材的品种是非常必要的,为今后雪莲的开发应用提供了必要的信息.