转Bt基因抗虫水稻的进展

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摘 要：介绍了Bt基因及转Bt基因抗虫水稻的作用机理,综述了转Bt基因水稻的研究概况,分析了转Bt水稻的生物安全性,并展望了Bt水稻的发展趋势,以期为Bt水稻的安全性评价及大规模商业化种植提供参考.

关 键 词：水稻；Bt基因；转基因；抗虫

中图分类号：S511文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2012.06.003

水稻（Oryzasativa）是世界上最重要的粮食作物之一,全球近半数人以稻米为食.2001─2025年,世界对水稻的需求量大致每年增加1%,相当于这一时期亚洲人口的增长率.世界上水稻的种植范围很广,其中中国是最大的产稻国,其水稻产量占世界稻米总产量的1/3[1],因此,水稻种植带来的产值在我国国民经济中占有十分重要的位置.与此同时,水稻同样也是受到害虫侵害最为严重的农作物之一[2].长期以来,为害我国水稻的主要害虫有螟虫（稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟）和稻飞虱,主要病害有稻瘟病、白叶枯病、纹枯病等[3],每年因虫害造成水稻产量损失约为10%[4].在过去的几十年中,化学防治一直是水稻害虫防治的主要方法,但在减轻害虫危害、提高水稻产量的同时也产生了新的问题.化学杀虫剂的长期使用造成了严重的环境污染、生态的失衡、生产成本提高、水稻品质下降以及害虫本身产生抗药性等问题.随着植物分子生物学技术和基因工程技术的飞速发展,有大量文献报道,培育自身具有高抗虫性的水稻已成为现实[5-9].

1Bt基因及转Bt基因抗虫水稻的作用机理

1.1Bt基因的简介

Bt基因即苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis,简称Bt）基因,由于其具有杀虫效果好、安全性高、高效等优点,已成为现今世界上应用最为广泛和最有应用前景的抗虫基因.首次发现苏云金芽孢杆菌是在1902年,发现该菌的学者是日本生物学家ShigetaneIshiwatari；再次分离出该杆菌是在1911年的德国苏云金省,分离出该杆菌的学者是ErnstBerline,并将该菌命名为苏云金芽胞杆菌[10-11].苏云金芽孢杆菌是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌,其主要的杀虫活性成分——杀虫晶体蛋白（insecticidalcrystalproteins,ICP）,也称为δ-内毒素,是苏云金芽孢杆菌在芽孢形成过程中产生的.典型的ICP由两部分组成,N端的活性片段和C端的结构片段,编码杀虫晶体蛋白的基因通称为Bt或Cry基因.许多ICP的氨基酸序列存在不同程度的同源性,由Crickmore等人组成的Bt基因命名委员会在1995年召开的无脊椎动物病理会年会上提出了以杀虫蛋白氨基酸序列同源性为唯一标准的分类命名体系.同源性在45%以下,为第一等级,用阿拉伯数字表示；同源性在45%～78%之间,为第二等级,用大写英文字母表示；同源性在78%～95%之间,为第三等级,用小写英文字母表示；同源性在95%以上,为第四等级,用阿拉伯数字表示,例如Cry1Aa1基因[12].自1981年Schnepf等[13]首次克隆出Cry（crystalproteingene）基因以来,新的Bt基因不断地被发现,截止2012年8月,Bt基因已达到73个大类,总计667个基因序列[14].这些杀虫晶体蛋白可作用于鳞翅目、双翅目、鞘翅目等靶标昆虫和线虫,还能溶解细胞.

1.2转Bt基因水稻的抗虫机理

经转基因技术将Bt毒蛋白导入水稻后,一般认为Bt毒蛋白的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入和孔洞或离子通道的形成5个环节[15].研究表明,Bt毒蛋白可溶解于pH值大于12或pH值小于9.5并加有巯基试剂的碱性溶液中[16].鳞翅目昆虫幼虫中肠的pH值呈碱性,有利于Bt毒蛋白的溶解,这也是苏云金芽孢杆菌对鳞翅目昆虫有高效毒杀作用的原因之一.Bt毒蛋白的重要杀虫成分ICP自身没有生物活性,又名原毒素（protoxin）,通过昆虫的取食可在昆虫中肠的碱性环境中被溶解,溶解的Bt毒蛋白被中肠蛋白酶水解为毒素核心肽段,这些活力肽段能与中肠上皮的特异性受体专一性结合,进而毒蛋白插入细胞膜中形成孔洞或离子通道,使膜的完整性遭到破坏,引起细胞渗透失衡,细胞膨胀并溶解,最终导致昆虫死亡.

对Bt毒蛋白导致害虫死亡的组织病理学研究表明,二化螟5龄幼虫取食转Bt（Cry1Ab）基因抗虫水稻后,中肠上皮细胞中的细胞器会发生很大的变化,如线粒体和内质网的形态会发生明显变化,在病变的过程中会出现粗糙内质网的肿胀和核糖体脱落等现象.与对照相比,取食Bt水稻后的二化螟幼虫肠道内弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性呈下降趋势,而强碱性类胰蛋白酶的活性则呈上升趋势[17].在正常的稻纵卷叶螟3龄和5龄幼虫肠道内,中肠上皮柱状细胞顶部的微绒毛数量比较多,细胞质均匀,细胞器丰富.当这些稻纵卷叶螟幼虫取食Bt水稻后,柱状细胞的微绒毛有脱落现象,且随着取食时间的增加,中肠上皮细胞中的细胞质透明化,细胞器的数量减少[18].

2转Bt基因抗虫水稻概况

转基因水稻是继转基因大豆、玉米、棉花和油菜等之后又一个备受国际重视且发展显著的产业.转Bt基因水稻是利用转基因技术将苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白基因作为外源基因导入水稻获得的,对鳞翅目害虫（如稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟等）具有良好的抗性[19].虽然发现了上百种Bt基因,但是仅有很小的部分被导入水稻中进行抗虫性测定.转Bt基因水稻最初常以Cry1A类为主,如Cry1Ab、Cry1Ac、融合基因Cry1A（b）/Cry1A（c）[20]等,现在Bt抗虫水稻无论从方法上还是成果上均已取得了巨大进展.

自20世纪80年代中期以来,研究人员运用不同的转基因技术获得了不同种类的Bt抗虫水稻.杨虹等[5]报道了通过聚乙二醇（PEG）法将Bt基因导入水稻,谢道昕等[21]通过花粉管通道技术把Bt基因成功地导入水稻中,Fujimoto等[7]采用电激法将通过修饰的Cry1Ab基因导入粳稻,首次得到了高表达Bt蛋白的水稻植株,具有良好的抗虫性.Wünn、Ghareyazie、许新萍等研究者分别利用基因法将Bt基因成功地导入水稻中获得了转基因植株,且抗虫性较好[8,22-24]；Chan、Cheng、项友斌等分别报道了用农杆菌转化法将Bt基因导入水稻,获得了可育的、抗虫性良好的转基因植株[9,25-28].随着水稻遗传转化技术的不断成熟,基因法和农杆菌介导的转化方法成为目前转基因水稻中常用的两种方法.随着对转Bt基因抗虫水稻研究的不断深入,人们发现转单价Cry1A类抗虫水稻植株的抗虫谱单一,害虫对转基因植株耐受性增强.为了解决这些问题,并且使水稻能够高抗和多抗,增强Bt水稻的抗虫性,国内外的研究者们开始试验运用除Cry1A类以外的其它基因,随后陆续报道了运用经人工改造合成的Bt抗虫基因,如用改造的Cry2A、Cry1B、Cry1C等培育的对水稻螟虫具有不同程度抗性的水稻[29-34].同时,协同转化两个或多个抗性基因的研究也在进行,如Maqbool等[35]首次将Cry1Ac和Cry2A两个Bt基因转入水稻中；Bashir等[36]将Cry1Ac和Cry2A协同导入籼稻中,得到的转双价基因植株对三化螟和稻纵卷叶螟具有高抗性.卫剑文等[32]采用基因法把Bt基因Cry1Ab与大豆胰蛋白酶抑制剂基因（SBTi）共同导入到优良籼稻中,获得的植株对稻纵卷叶螟的抗虫性增强,李永春等[37]通过农杆菌介导法把双价抗虫基因Cry1Ac和CpTi（豇豆胰蛋白酶抑制剂）转入粳稻中,得到了对二化螟高毒性的植株.中国科学院Huang等[38]得到了转Cry1Ac和经修饰的CpTi双价基因水稻,对大螟、二化螟以及稻纵卷叶螟有高抗性,已进入环境释放阶段.沈志成等[39]将融合Cry1Ab/vip3基因导入水稻,得到对二化螟和稻纵卷叶螟抗性良好的植株,冯道荣等[40]首次运用基因法把含有多个抗虫抗病基因（Bt+pinII+bar）的载体转入水稻,并得到了既抗虫又抗病的植株.Maqbool[41]在2001年又研究了转Cry1Ac+Cry2A+gna三价基因的籼稻,结果表明它们对水稻害虫的抗性显著,Ramesh等[42]把人工合成的Cry1Ab/Cry1Ac融合基因和gna基因一同转入籼稻,获得的转基因株系对鳞翅目和同翅目害虫均表现出显著抗性.

全球转基因水稻的研究发展迅速,实验中应用最为成功的抗虫基因是对鳞翅目害虫有显著控制作用的Bt基因.转Bt基因抗虫水稻是当前研究最为成熟和最接近实现商品化的转基因水稻品种之一[43].2000年以来,美国先后批准6个抗除草剂和药用转基因水稻,伊朗批准了1个转基因抗虫水稻商品化种植；加拿大、墨西哥、澳大利亚、哥伦比亚这4国批准了转基因水稻进口,允许食用[44].2009年,我国为转基因抗虫水稻品系‘华恢1号’和‘Bt汕优63’发放了安全证书,它们是由华中农业大学培育的高抗鳞翅目害虫转基因水稻.科学家将人工改造合成的Bt杀虫蛋白融合基因Cry1Ab/Cry1Ac转入水稻恢复系‘明恢63’,培育出抗虫水稻‘华恢1号’.中国是世界上第三个批准转基因水稻的国家,将成为世界上种植转基因水稻面积最大的国家.

3转Bt基因抗虫水稻的安全性

水稻作为百姓的主粮,它的产业发展一直备受人们的关注和重视.转基因水稻的出现,可以减少水稻病害虫的发生,减少农药用量和环境污染,节省投入成本,解决人类粮食紧张问题.Bt作为外源基因导入水稻所产生的安全性问题已成为社会广泛关注的热点.转Bt基因水稻的安全性包括食品安全和生态安全.转基因稻米是人们直接食用的产品,关系到人类的生命健康和安全.鳞翅目害虫等靶标昆虫的中肠上皮细胞含有Bt蛋白的特异性受体,而人类肠道上皮细胞没有该蛋白的结合位点,因此Bt蛋白不会对人造成伤害.在营养学评价方面,转基因水稻与非转基因对照水稻在主要成分、微量营养成分以及抗营养因子等方面都没有生物学意义上的差异.在毒理学评价方面,转基因稻米对大鼠进行90d喂养试验、慢性毒性试验,结果表明Bt稻米对哺乳动物是安全的[45].

转Bt基因水稻的生态安全性也是人类关注的问题,转基因水稻的种植是否会产生基因漂流,以及是否会对非靶标性昆虫、生物多样性以及土壤环境等造成影响都需要进一步深入研究.现有的研究表明,转Bt基因抗虫水稻对稻田生态系统是安全的；Bt水稻对稻田节肢动物群落影响明显弱于化学杀虫剂,用Bt水稻防治害虫比用化学杀虫剂更有利于保持稻田生物群落的稳定性和保护稻田中害虫的天敌.转Bt基因水稻对土壤微生物和酶活性有一定的影响,关于这方面的研究应该在不同生态区开展长期的定位监测和评价.Bt水稻对人类、环境、生态的安全性还需要多层次、多角度地进行深入和持久的研究.

4展望

转基因抗虫水稻经过20多年的发展,已硕果累累且前景广阔.在生物技术快速发展的今天,我国作为一个农业大国,应力争走在转基因育种技术领域的最前沿.面对人口众多的基本国情,我们在保证

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目前,水稻转基因技术已成熟,但距大规模运用遗传工程技术改良水稻品种、生产转基因水稻还有遥远的距离.转基因抗虫水稻虽然在安全性研究方面已取得了一定成就,但还存在许多未知领域.因此,加快建立关于转基因水稻安全性评价体系的标准是一项刻不容缓的工作.转Bt基因抗虫水稻为防治害虫提供了一条经济便捷的途径,它必将带来大规模的商品化种植,然而对它的安全性还需要从对人类、环境和生态等方面进行长期和深入的研究.

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[40]冯道荣,许新萍.多个抗病抗虫基因在水稻中的遗传和表达[J].科学通报,2000,45（15）：1593-1599.

[41]MaqboolSB,RiazuddinS,LocNT,etal.Expressionofmultipleinsecticidalgenesconfersbroadresistanceagainstarangeofdifferentricepests[J].MolecularBreeding,2001,7（1）：85-93.

[42]RameshS,NagadharaD,ReddyVD,etal.Productionoftransgenicindicariceresistanttoyellowstemborerandsap-suckinginsects,usingsuper-binaryvectorsofAgrobacteriumtumefaciens[J].PlantScience,2004,166（4）：1077-1085.

[43]陈浩,林拥军,张启发.转基因水稻研究的回顾与展望[J].科学通报,2009,54（18）：2699-2717.

[44]中国农科院生物技术专家林敏就转基因安全问题答记者问[EB/OL].[2010-07-20]http：//.moa.gov./ztzl/zjyqwgz/zxjz/201007/t20100720_1602120..

[45]王忠华,王茵,崔海瑞,等.Bt水稻“克螟稻”稻米毒理性评价研究初报[J].中国农业科学,2002,35（12）：1487-1492.