反相高效液相色谱法对畜产品中三聚氰胺残留的检测

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摘 要:建立了畜产品包括生鲜乳、禽蛋、禽肉中三聚氰胺残留检测的反相高效液相色谱方法.样品经1%的三氯乙酸提取,饱和乙酸铅沉淀蛋白.经固相萃取柱MCX净化,于高效液相色谱仪紫外法测定,外标法定量.三聚氰胺在0.2~20.0μg/mL范围内线性良好,相关系数为0.9998.在0.2~1.0mg/kg浓度范围内,平均加标回收率在70%以上,批内变异系数在10%以内,批间变异系数在15%以内.方法的检出限为0.05mg/kg,定量限为0.10mg/kg.该方法定量限低,回收率高,可以同时测定多种样品,方便省时,满足农产品检验工作的需要.

关 键 词:三聚氰胺;畜产品;高效液相色谱法(HPLC);MCX固相萃取柱

中图分类号:TS252.7文献标识码:A文章编号:1007-273X(2013)06-0011-04

1材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1试剂与材料除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为millipore超纯水.甲醇(色谱纯);氨水(含量为25%~28%);三氯乙酸;柠檬酸;庚烷磺酸钠(色谱纯);乙酸铅;WatersMCX固相萃取柱(60mg,3mL);滤膜(0.45μm,有机相);氮气(纯度大于等于99.999%);三聚氰胺标准品(纯度>99%).

1.1.2仪器与设备高效液相色谱仪(waters2695)配有紫外检测器;离心机;超声提取器;旋涡混合器;震荡摇床;固相萃取装置;氮吹仪;分析天平(感量为0.00001g和0.01g).


1.2方法

1.2.1标准储备液配制及标准曲线的绘制准确称取100.0mg(精确到0.1mg)三聚氰胺标准品于100mL容量瓶中,用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,配制成浓度为1mg/mL的标准储备液,于4℃避光保存.有效期3个月.

准确移取20.00mL标准储备液,于100mL容量瓶中,用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,配制成浓度为0.2mg/mL的稀释液.用流动相逐级稀释得到浓度为0.2、0.5、1、2、5、10、20μg/mL的标准工作液,浓度由低到高进样检测以峰面积-浓度作图得到标准曲线回归方程.

1.2.2三聚氰胺样品前处理①称取样品5.00g(精确至0.01g)试样于50mL具塞塑料离心管中,加入20mL1%三氯乙酸溶液和1mL饱和乙酸铅,超声提取10min,再振荡提取10min后,以不低于10000r/min离心5min,上清液待净化.②依次用3mL甲醇、3mL水活化MCX固相萃取柱,将待净化液转移至固相萃取柱中,依次用3mL水和3mL甲醇洗涤,抽至近干后.③用5mL5%氨化甲醇溶液洗脱,用试管收集洗脱液.整个固相萃取过程流速不超过1mL/min.④洗脱液于50℃下用氮气吹干.⑤残留物用1mL流动相定容,涡旋混合1min,过0.45μm微孔滤膜后,供HPLC测定.

1.2.3定量限和检测限的测定最低检测限和最低定量限的确定,是根据信噪比(S/N)的值来确定的.称取6份空白组织,按照“1.2.2”步骤处理后,测得基线噪音值,求其平均值.

按照信信噪比S/N等于3时相对的添加浓度为检测限,S/N等于10时相对的添加浓度为定量限.

1.2.4添加回收率和精密度测定称取试样(5±0.05)g于50mL离心管中,加入适量标准贮备液,使其各农产品添加浓度分别为0.1、0.2、1.0μg/kg,每个添加浓度设5个平行,按照1.2.2项下步骤操作进行测定,根据峰面积计算添加回收率和批间、批内变异系数.

1.2.3高效液相色谱测定HPLC参考条件:①色谱柱C18柱,250mm×4.6mm,粒度5μm,或相当者.②流动相:离子对试剂缓冲液(准确称取2.10g柠檬酸和2.02g庚烷磺酸钠于1L容量瓶中,用水溶解并稀释至刻度)-乙腈(90+10,V/V),混匀.③流速:1.0mL/min.④柱温:40℃.⑤波长:240nm.⑥进样量:20μL.

2结果与分析

2.1线性关系

在浓度为0.2~20.0μg/mL的范围内,三聚氰胺的峰面积与其浓度呈线性相关,见表1.

2.2检测限和定量限

根据6个空白组织的基线噪音平均值,按信噪比S/N等于3为检测限,S/N等于10为定量限,求得在生鲜乳、禽蛋、禽肉中检测限为0.05mg/kg,定量限为0.10mg/kg.

2.3添加回收率和精密度

在生鲜乳、禽蛋、禽肉中添加浓度为0.1、0.2、1.0μg/kg的三聚氰胺,进行添加回收试验,各产品的平均回收率在70%以上,批内变异系数在10%以内,批间变异系数在15%以内.结果见表2~表6.

3结论

建立了农产品包括生鲜乳、禽蛋、禽肉中三聚氰胺残留检测的反相高效液相色谱方法.样品经1%的三氯乙酸提取,饱和乙酸铅沉淀蛋白.经固相萃取柱MCX净化,于高效液相色谱仪紫外法测定,外标法定量.三聚氰胺在0.2~20.0μg/mL范围内线性良好,相关系数为0.9998.在0.1~1.0mg/kg浓度范围内,平均加标回收率在70%以上,批内变异系数在10%以内,批间变异系数在15%以内.方法的检出限为0.05mg/kg,定量限为0.10mg/kg.该方法定量限低,回收率高,可以同时测定多种样品,方便省时,满足农产品检验工作的需要.

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