基因工程在马铃薯育种中的应用现状

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作者简介：刘玲玲（1977-）,女,讲师,硕士,研究方向为生物技术在作物遗传育种中的应用研究.

摘 要：近年来,基因工程技术广泛应用于马铃薯抗病、抗菌、抗虫、抗除草剂、品质改良及生物反应器的研究中并取得了一定进展.本文综述了近20年国内外基因工程在马铃薯育种上的应用现状,为马铃薯产业的大力发展提供了理论依据.

关 键 词：基因工程；马铃薯育种；应用现状

中图分类号：S532.035.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）06-0130-04

马铃薯（Solanumtuberosum）是世界上广为种植的粮、菜、饲兼用型作物,也是我国干旱和半干旱地区重要的经济作物,可以加工制成各种产品[1],其栽培面积仅次于小麦、水稻和玉米.全世界每年的总产量将近3×108t,中国占了其中的18%,居世界第一位[2].马铃薯以其独特的经济价值受到了国内外的广泛关注,尤其近年来随着生物能源的兴起与开发,马铃薯也被视为一种新型的能源材料,从而掀起了对马铃薯生物学性状及应用的研究热潮[3].

马铃薯为同源四倍体作物,其遗传分离复杂、后代筛选繁琐,用常规育种方法改良品种难度极大.尽管已培育出许多食用加工的优良品种,但至今许多优良栽培品种仍受到多种病虫害等的严重危害.近些年发展起来的植物基因工程技术,可以将各种来源的基因导入马铃薯,使马铃薯基因工程取得了许多突破,显示出诱人的前景.

1马铃薯抗病基因工程

11马铃薯抗病毒病基因工程

病毒病是马铃薯的主要病害之一,也是造成马铃薯退化的主要原因,严重危害着我国马铃薯的生产.随着病毒检测技术的发展,人们发现几乎所有马铃薯品种都受到一种或几种病毒的侵染[4].目前已报道的侵染马铃薯的病毒有40余种[5],国内发现的专门寄生于马铃薯的就有9种,即马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒（PVS）、马铃薯A病毒（PVA）、马铃薯M病毒（PVM）以及马铃薯卷叶病毒（PLRV）[6].其中马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒是最主要的马铃薯病毒[7].而且PVY+PVX或PVY+PLRV混合侵染带来的损失远远大于各病毒单独侵染.

马铃薯抗病毒基因工程主要有病毒外壳蛋白（CP）基因的交叉保护作用,RNA和反义RNA介导的抗性,核酶、缺损的复制酶基因介导的抗性以及干扰运动蛋白等[8].在以上技术中,利用病毒外壳蛋白基因介导植物产生抗病性是目前马铃薯抗病毒基因工程的热点之一.近十多年来,应用生物工程技术将病毒外壳蛋白（CP）基因导入马铃薯的研究工作已取得重要进展[9],有些学者鉴定了表达PVX+PVY双价CP基因转基因马铃薯的抗病性,结果表明转基因马铃薯对PVX+PVY复合感染产生不同程度的抗性[10].利用反义RNA技术,有些学者用非翻译的序列转化植株也能产生抗性,RNA与反义RNA转化阻碍翻译的进行,导致基因产物减少[11].马铃薯抗病毒基因工程的成果还有很多,随着对病毒与植物相互作用机理的深入研究,抗病毒基因工程在育种上将会发挥更大的作用.

12马铃薯抗真菌病基因工程

真菌性病害也是限制马铃薯产量和品质的主要病害之一,马铃薯真菌病害种类繁多,其中最主要的是晚疫病菌（Phytophthorainfestans）,往往造成马铃薯大幅度减产.近年来通过基因工程技术在马铃薯抗真菌病方面取得一定的进展.在马铃薯抗真菌病基因工程育种中大量使用的主要有植物病程相关蛋白、水解酶——几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶、抗真菌蛋白（肽）、抑制病原菌毒性因子的蛋白等等.付道林等[12]将携带有Ⅰ型烟草β-1,3-葡聚糖酶基因和Ⅰ型菜豆几丁质酶基因的pBLGC质粒导入津引8号马铃薯品种中,获得了抗病转基因品种.Ali等[13]将人工合成的4种阳离子肽基因导入马铃薯并对马铃薯病原真菌和细菌的抗菌活性进行了测试,所获得的转基因植株对相应病原菌的抗性都得到一定程度的增强.

13马铃薯抗细菌病基因工程

近年来植物抗细菌病基因工程研究取得的进展,主要表现在阻断病原细菌的致病途径,强化植物抗病反应及其信号转导途径,植物防御基因的表达,利用非植物源抗菌蛋白和利用细胞凋亡反应控制病害的发生等方面.Dong等[14]将克隆于芽孢杆菌的N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）水解酶基因aiiA转入烟草和马铃薯,转基因烟草和马铃薯对软腐病菌（Erwiniacarotovora）的抗性显著提高.贾士荣等[15]将人工合成的CecropinB及ShivaA基因转入我国7个马铃薯主栽品种中,经温室和田间接种试验鉴定,部分转基因材料对青枯病的抗性比对照提高1～3级.

2马铃薯抗虫基因工程

在马铃薯的整个生育期,常常遭受各种害虫的侵袭,如蚜虫、马铃薯块茎夜蛾、蛴螬等,直接危害地上与地下部分,造成产量和品质下降,甚至导致死亡.迄今为止,各国研究人员已经利用基因工程技术分离得到了不同来源的抗虫基因,其中用于提高植物抗虫性的主要有两类：一类是从细菌中分离出来的抗虫基因,如苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因（Bt基因）；另一类是从植物中分离出来的抗虫基因,如蛋白酶抑制剂基因（PI基因）、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等.其中,Bt基因和PI基因在农业上应用最广[16].Arpaia等[17]的研究结果表明,雌性科罗拉多甲虫取食了含有cry3B的转基因马铃薯后,生殖能力受到了严重损害,不能产生后代.Marchetti等[18]从大豆中分离得到了几种蛋白酶抑制剂基因（KTi3、C-ⅡandPⅠ-Ⅳ）,并将其导入马铃薯中,经检测在表达足够数量抑制剂的情况下,幼虫重量的增加降低50%.

3马铃薯抗除草剂基因工程

通过化学方法控制杂草已成为现代化农业生产中不可缺少的一部分,但除草剂在杀死杂草的同时不仅污染环境,有的还会对农作物的生长产生伤害.而通过基因工程技术将耐除草剂基因导入作物,增加了对除草剂的选择性和安全性[19].耐除草剂基因工程主要从两个方面解决问题,一是修饰除草剂作用的靶蛋白,使其对除草剂不敏感,或使其过量表达让植物吸收除草剂以后仍能进行正常代谢；二是引入酶或酶系统,在除草剂发生作用前降解或解毒.如比利时植物遗传部门的研究人员把编码乙酰CoA转移酶的Bar基因导入马铃薯,获得耐除草剂的转基因植株.4马铃薯抗逆基因工程

干旱、高温、低温、盐胁迫等逆境条件影响马铃薯生长,严重时甚至导致死亡.随着分子生物学的发展,研究者从基因组成、表达调控及信号传导等方面进行深入研究,明确植物对逆境胁迫的耐（抗）性机理,将相关基因导入马铃薯以改良胁迫抗性.例如,Goddijn等[20]成功地将大肠杆菌海藻糖合成酶基因复合体otsAB基因导入马铃薯,明显提高了转基因植株的抗旱性.赵映琴[21]将AtNHX1基因转入马铃薯株系中,在相同盐浓度胁迫下,转基因马铃薯的株高明显高于对照,尤其是在高盐条件下胁迫90d时,大部分转基因株系的株高均显著高于对照.

5马铃薯加工品质改善基因工程

51马铃薯淀粉品质改良基因工程

在淀粉的生物合成过程中,影响淀粉品质的关键酶是淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）,它们共同作用影响淀粉颗粒的结构和特性.利用基因工程手段改变这些酶在植物中的表达,从而获得具有独特性质、新型的马铃薯淀粉用于食品加工或其它工业生产之中.宋波涛等[22]通过根癌农杆菌介导法将CaMV35S驱动的正/反义sAGP基因导入马铃薯后,转正义sAGP基因的淀粉含量增加5%～6%,而转反义sAGP基因淀粉含量下降达27%.在马铃薯中,AGPase水平降低时,直链淀粉含量显著降低,而支链淀粉含量升高[23].

52马铃薯块茎抗褐变基因工程

多酚氧化酶（Polyphenoloxidase,PPO）是产生褐变现象的主要原因.许多研究者运用反义RNA技术特异抑制PPO的表达,从而达到抑制马铃薯褐化的目的.如Bachem等[24]将反义多酚氧化酶基因导入马铃薯,能够有效增强块茎的抗褐变能力.

53马铃薯块茎抗低温糖化基因工程

据资料介绍,块茎在低温贮藏条件下的低温糖化给马铃薯加工产业带来的损失高达数千万美元.于是,人们借助基因工程技术来解决这一难题.张金文[25]克隆了马铃薯栽培品种“甘农薯1号”的酸性转化酶基因,构建了反义植物表达载体,获得了转基因植株.除了运用反义RNA技术外,还可通过表达自身或外源的酸性转化酶抑制因子来改善马铃薯低温糖化.如超量表达烟草酸性转化酶抑制子的马铃薯在4℃低温贮藏后块茎中的还原糖含量与液泡酸性转化酶的活性都显著降低,两者呈正相关[26].张琼[27]用低温诱导块茎特异表达融合启动子pCL与pCLMlb的反义转基因株系,结果酸性转化酶的活性显著降低,进而引起还原糖含量不同程度的下降.

6马铃薯生物反应器基因工程

马铃薯作为生物反应器的基因工程主要有：利用马铃薯生产疫苗、植物抗体、蛋白质多肽药物、糖类物质、工业可降解塑料的原料及可降解生物塑料等.Zhang等[28]利用农杆菌介导将人免疫缺陷Ⅰ型病毒HIV-1p24蛋白插入马铃薯基因组,叶片中的表达量为35mg/g.李晋涛等[29]报道,将人源轮状病毒（RV）转入马铃薯,并用小鼠口服该转基因植株进行免疫应答研究,结果显示,人源轮状病毒转基因植物疫苗联合黏膜佐剂免疫动物可诱导特异的系统与黏膜免疫应答,且黏膜免疫强度略高于系统免疫.谢安勇等[30]利用聚合酶链式反应（PCR）技术,从真养产碱杆菌H16染色体DNA中扩增并克隆了调控PHB生物合成的phbB和phbC基因；雍伟东等[31]将多聚β-羟基丁酸酯（PHB）合成过程中所需的2种酶phbB和phbC的编码基因转入到马铃薯体内,并采用特定的启动子使这些基因的编码蛋白最后定位在细胞的叶绿体中,结果表明,转基因马铃薯叶片中PHB干物质的含量可以达到0025～1800g/kg,并且这些外源基因的表达并不影响马铃薯的生长和育性.

7前景展望

马铃薯基因工程育种在短短十几年中已取得了丰硕成果,其在抗虫、抗病、抗逆等方面具有传统育种和生产无法比拟的优越性,提高了对病虫的抵抗和防御能力,增强了对干旱高盐的适应性,并能减少化学农药的使用量及保护生态环境,为培育马铃薯优良品系开辟了一条崭新的道路.同时,作为生物反应器,生产人们所需要的大量疫苗和药物,可供人类和家畜直接使用,便捷可靠.但是,目前马铃薯基因工程还受许多因素的制约,如转基因效率低和转基因生物安全性等问题.为了更好地发展和应用这项技术,在今后的研究中应着重解决以下问题：首先继续发现新型、高效基因,并研究其机制；其次应加强研究目的基因在转基因植株后代中的遗传、表达稳定性；且深入

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