光电化学竞争法检测生物素

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摘 要[HTSS]建立了光电化学系统竞争性检测生物素（Biotin）小分子浓度的方法.采用联吡啶钌[Tris（2,2′bipyridine）ruthenium,Rubpy）]作为标记物,以氧化锡纳米颗粒为电极,草酸盐为电子供体还原标记物.在470nm光激发下,联吡啶钌的外层电子吸收能量后由基态变为激发态,注入半导体氧化锡纳米颗粒电极的导带,形成光电流信号；草酸盐还原失去电子的联吡啶钌使其恢复初始状态,从而可以再次作为电子供体受激发产生光电流信号.在竞争性检测生物素（Biotin）浓度时,亲和素（Avidin）吸附到氧化锡纳米颗粒电极表面作为识别元件,在浓度大于0.5g/L时能够达到最大的电极表面覆盖率.1μmol/LRubpybiotin与不同浓度Biotin组成的混合溶液与电极表面的Avidin发生亲和反应,光激发后检测光电流大小；当溶液中Biotin的浓度增加时,致使与电极表面Avidin结合的Rubpybiotin量减少,在光照射下光电流信号降低.这一竞争性光电检测方法检测Biotin时,检出限为8μg/L.本方法可进一步扩展,应用于有机化合物的竞争性免疫检测.

1引言

小分子普遍存在于人类生命活动以及所处的环境中.环境中多种持久性有机污染物也是有机小分子化合物,如多环芳香烃、氯代二苯并二恶英、多氯二苯并呋喃以及多氯联苯等.在诸多常用的检测小分子化合物的分析方法中,基于抗体识别的免疫检测方法在速度、通量和成本方面具有显著的优势.免疫检测小分子时,通常会采用竞争性检测的方式,即将待检测物标记后与其抗体结合产生可检测的信号；当加入未标记的待检测物时,与标记的待检测物竞争有限的抗体结合位点,导致信号下降[1].目前多种标记物和相关的检测方法与仪器已被开发应用,如放射性同位素、荧光染料、酶、氧化还原分子等.

目前量子产率最高的光电化学电池采用纳米TiO2颗粒膜组装在导电玻璃上,并利用表面吸附的钌吡啶化合物使之敏化[2],Kalyanasundaram等[3]对其它宽带隙半导体电极和敏化剂也进行了研究.使用敏化剂作为标记分子可以进行生物分子亲和反应的检测,并且光电化学检测方法理论上应该具有很高的灵敏度；因为在这种方法的激发信号（光）和检测信号（电流）不会产生相互干扰[4].利用Cd量子点（QuantumDots）[5]和纳米管[6,7]进行光电化学传感已有报道；Pandey等[8]利用DNA嵌入染料蒽醌作为指示剂光电化学检测溶液中的DNA,该方法中光激发的蒽醌在溶液中被电子供体还原,利用修饰的石墨碳原子电极可以检测氧化还原电位的变化.利用蒽醌的光电化学性质也可研究固定于金电极上的双链DNA的电荷传输性质,并可以用于疾病的单核苷酸多态性（SNP）分型[9].

半导体纳米颗粒电极较其它电极在光电化学检测中具有明显优势,可以显著提高检测灵敏度,本研究组在检测溶液中的DNA研究中已经证明[10].除利用半导体纳米颗粒电极检测DNA[11,12]外,还可利用纳米颗粒电极非标记检测了多巴胺（Dopamine）[13]和ATP[14]的浓度.关于光电化学检测生物结合反应已有报道,尤其值得注意的是抗体/抗原的结合反应的光电化学检测[15,16].

联吡啶钌作为标记物已广泛用于电化学发光检测免疫反应[17,18],可利用联吡啶钌合吩嗪（Ru（bpy）2dppz,dppz等于dipyrido[3,2a：2′,3′c]phenazine）与dsDNA具有高亲和性（K等于106-107L/mol）[19]的特点检测金电极表面固定的双链DNA[20,21].Zhang等[14]采用纳米颗粒电极和Ru（bpy）2dppz检测了癌细胞中ATP的浓度.

本研究组曾采用染料敏化的光电化学系统定量检测溶液中的DNA[10],该检测系统包括光电化学标记物Ru（bpy）2dppz,电子供体草酸盐和电极材料氧化锡纳米颗粒.由于该分析系统具有许多高量子产率光电化学太阳能电池的优点,所以在检测溶液中的DNA时,灵敏度比导体电极、金电极和碳电极有显著改善.本研究采用光电化学方法竞争性检测Biotin,Rubpybiotin复合物在此竞争性检测中作为光电化学标记分子；当各种浓度的Biotin（待检测物）与1μmol/LRubpybiotin混合溶液与电极表面的Avidin反应后,标记分子受激发所产生的光电流会随Biotin浓度的增加而减小.本方法对Biotin的检出限为8μg/L.本研究为采用光电化学方法竞争性检测小分子的浓度提供了参考.

2实验部分

2.1仪器与试剂

双（联吡啶）4′4羰基吡啶钌N琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯（Rutheniumbis（2,2′bipyridine）（4methyl4′carboxyl2,2′bipyridine）NHSester（RuNHS）,美国Fluka公司）；Avidin和Biotin（美国Sigma公司）；Succinimidyl6（biotinamido）hexanoate（biotinLCNHS,美国Pierce公司）.WLTNSI090铟锡氧化物镀膜玻璃（涂层（96±4）nm,片电阻（18±2）Ω）,深圳伟光股份有限公司）.

2.2实验步骤

2.2.1Rubpy标记idin和biotinRubpy标记Avidin按文献[22]方法进行.Rubpybiotin（图1）的合成：向溶于二甲酰胺（Dimethylformamide,DMF）的RuNHS中加入10倍过量的乙二胺,冰浴中反应1h；在减压情况下,去除未反应的乙二胺和DMF；将所得固体溶解在丙酮中,加入沉淀；沉淀所得固体和biotinLCNHS以摩尔比2∶1溶解在DMF中,室温反应3h,SephadexG25柱分离产物.产物通过NMR,UVVis吸收和循环伏安法表征.[TS（]图1Rubpybiotin复合物的结构Fig.1Structureoftris（2,2′bipyridine）ruthenium（Rubpy）biotinconjugate[HT5][TS）]

2.2.2Biotin和Avidin的结合反应氧化锡电极按文献[22]方法制备.氧化锡电极吸附Avidin的方法是以25μLAvidin蛋白溶液覆盖0.5cm2电极表面,静置30min；以20mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）冲洗后,用1%牛血清白蛋白封闭电极,以减少非特异性结合.进行Biotin和Avidin之间的结合反应时,将25μLBiotin或Rubpybiotin混合液覆盖在Avidin吸附的电极上,并在无外力混合情况下室温反应1h；冲洗后,在电解液中测定光电流.

2.2.3光电流测定光电流测定用CHI800型电化学分析仪,Pt作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极,电极间所加偏压为+0.3V；激发光源来自蓝色发光二极管（深圳Lamp公司）,照明面积为0.2cm2.在进行光谱测量时,500W的氙灯和光栅用于产生单色可变波长的光,用于激发.

3结果与讨论

3.1检测条件的优化

本研究以Biotin/Avidin为模式系统,研究光电化学方法检测小分子的可行性.Biotin是一种水溶性维生素（244Da）.Avidin是蛋清中存在的糖蛋白（66kDa）.Avidin和Biotin的亲和性非常高,解离常数为1015mol/L.Avidinbiotin系统已被广泛用于免疫组化、酶联免疫吸附分析以及分子生物学测定.本实验将Avidin固定在氧化锡电极表面,使之捕获溶液中的Biotin或Rubiotin,通过测量Ru标记物产生的光电流测量溶液中Biotin的浓度（图2）.

Avidin含有碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸,等电点约为10,易于吸附到带负电荷的电极表面.实验表明,Avidin对氧化锡电极的吸附性很强,所以采用吸附法在电极上固定Avidin.将电极在各种浓度的AvidinRu中浸泡2h,冲洗后,通过测量光电流评估蛋白吸附效果.由图3可见,当AvidinRu浓度从0增加至1g/L时,光电流先随溶液中AvidinRu浓度增加而增大；AvidinRu浓度大于0.5g/L时,光电流达到平台期,证明在这种浓度下蛋白吸附趋于饱和.表面固定的AvidinRu保持相对稳定,[TS（]图3吸附在氧化锡电极上的AvidinRu产生的稳态光电流与AvidinRu浓度之间的关系,小图：AvidinRu吸附的氧化锡电极浸泡在Ph7.5,20mmol/L磷酸盐缓冲液中（a）0h（b）2h后的光电流

Fig.3SteadystatephotocurrentofRulabeledidinadsorbedonSnO2electrodeasafunctionoftheproteinconcentration.Inset：PhotocurrentofRulabeledidincoatedSnO2electrodeaftersoakingin20mmol/Lphosphatebuffer,pH7.5for（a）0h（b）2h

光电流测定采用pH5.5,10mmol/L草酸钠/100mmol/L磷酸钠溶液,以470nm光激发.

为了平衡光电信号和灵敏度的要求,标记物剂浓度选择1μmol/L用于竞争性检测.对照实验采用吸附牛血清白蛋白（BSA）的电极与1μmol/LRubpybiotin反应.它的光电流仅为吸附Avidin电极的1/3,并和未与Rubpybiotin的BSA电极产生的光电流相同,对比证明吸附Avidin电极产生的光电流响应是由于Avidin和Botin之间的特异性相互作用.电极吸附Avidin反应的Rubpybiotin受激发产生光电流时,光电流随激发光波长的变化情况见图5.光电流的谱形类似自由标记分子（插图）的吸收光谱,在470nm处达到峰值.Avidin/氧化锡电极本身并未表现出波长依存性,证明光激发所产生的光电流是由金属Ru络合物引起的.

3.2检测溶液中biotin的浓度

确定了标记物Rubpybiotin的浓度后,在吸附了idin的氧化锡电极上竞争性检测Biotin浓度.检测时,各种浓度的Biotin与1μmol/LRubpybiotin混合,并与吸附了Avidin的本研究组曾采用相同的光电化学检测系统定量检测了溶液中DNA的浓度[10].在本实验中.利用标记物竞争性检测Biotin浓度,检出为8μg/L,可与一些酶标记的电化学免疫测定方法相媲美.优化检测系统和反应条件,如氧化锡薄膜结构、固定方法以及借助外力使溶液混合均匀,还有可能提高检测灵敏度.本方法可推广应用到以抗体或受体作为识别元件检测其它小分子.联吡啶钌和相关的联吡啶类化合物的配基可以由多种官能团衍生而来,如羧基和氨基,用于小分子的共价修饰[18].与多数免疫分析中的酶标不同,金属复合物标记体积小且较稳定,适合于苛刻条件下的检测.

尽管在本研究中以Biotin/idin模仿竞争性免疫检测反应,其实在日常生活中仅测定Biotin浓度也是实际需要的.Biotin几乎存在于所有活细胞中,缺乏会导致多种人类疾病.许多定量测定Biotin的分析方法已被开发应用,包括分光光度法、色谱法及Avidin结合测定法[23],而且最近一些Biotin金属的复合物在Avidinbiotin结合反应的研究中已被合成,并作为灵敏的荧光指示剂使用[24]；大多数

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