基因定点诱变在蛋白质工程中的应用

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在蛋白质工程中对蛋白质结构进行的设计改造,最终还必须通过基因来完成.设计改造后的蛋白质在自然界生物中不存在相应的基因,往往需要通过人工化学合成或基因修饰获得,其中基因修饰的主要方法就是基因定点诱变.如在高中生物人教版选修3教科书“蛋白质工程的崛起”这一节中谈到:“将天冬氨酸激酶的第352位的苏氨酸变成异亮氨酸,将二氢吡啶二羧酸合成酶中104位的天冬酰胺变成异亮氨酸,就可以使玉米叶片和种子中的游离赖氨酸分别提高5倍和2倍.”这个实例中,改造后的蛋白质基因与原始基因只有一个碱基对的差异,其所用的方法就是基因定点诱变.但是,基因突变往往是不定向的,是随机的,研究者如何让基因按照人的意愿进行定向突变呢?为什么没有用化学合成法合成基因呢?化学合成法有什么弊端吗?下面就这些问题作简要分析和阐述.

1基因定点诱变的原理和方法

基因定点诱变技术是蛋白质工程研究中的一种重要方法,其实质是利用化学合成寡核苷酸和基因重组技术相结合的方法,按照预定设计,对已知基因的特定碱基进行定点增删或转换,最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构.最具代表性的定点诱变方法有以下三种.

1.1寡核苷酸介导的定点诱变

利用人工合成的寡核苷酸可以制造任何部位的突变,而不受限制酶切点的限制(图1).如果希望改变某个DNA的某个特定碱基,可以先合成一条突变碱基位于中间的寡核苷酸,一般长度约15~20bp.这条寡核苷酸链除了突变碱基外,其余的序列与野生型DNA分子中的相应序列完全一致.然后将合成的寡核苷酸与由单链噬菌体做载体所携带的DNA克隆互补链混合,进行分子杂交.这段配对的寡核苷酸可以做为引物,在DNA聚合酶作用下合成完整的互补链,再用DNA连接酶连接起来.将此双链DNA导入大肠杆菌中,经扩增就可以得到大量可稳定遗传的的突变DNA克隆.

1.2盒式定点诱变

盒式定点诱变是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中相应序列.其中,合成的DN段称为“盒”.通常的做法是:先制备好含有正常目的基因的重组质粒,然后在目的基因需要突变的部位附近找两个限制酶位点,利用合适的限制酶将二者之间的DNA序列切掉,而由一段人工合成含有突变碱基的双链DN段通过DNA连接酶连接取代,从而达到基因定点突变的目的.此法的缺点在于突变区段的两侧需存在一对限制酶位点,限制了该方法的广泛应用.

1.CR介导的定点诱变

任何基因,只要知道两端及需要变异部位的序列,就可用PCR诱变去改造该基因序列.由于方法简便易行,结果准确高效,因此PCR介导的定点诱变已成为最常用的方法.

PCR定点诱变有两种情况.①变异部位位于基因的末端.这种情况只需在人工合成5'端或3'端引物时引入变异碱基,便可使PCR产物(目的基因)的末端引入变异.②变异部位位于基因的中间.这种情况需要借助重组PCR方法,可在DNA任意部位产生定点诱变(图2).首先在需要诱变的位置合成含有变异碱基的互补引物(引物b和c),然后分别与3'引物(引物a)和5'引物(引物d)进行PCR,这样便可得到两个PCR产物分别含有变异碱基,由于二者中间有一段序列彼此互补重叠,在重叠部位经重组PCR就能得到基因的中间含变异碱基PCR产物.重组PCR不仅可在基因任意位点引入变异,还可在不同基因片段之间发生重组连接.

2化学合成法的局限性

DNA的化学法合成不需要模板,在蛋白质改造中可以依据研究人员设计的核苷酸序列直接合成基因.那么为什么不都用化学方法直接合成突变基因呢?这是由于化学法合成DNA的缺陷造成的.首先,化学合成的是单链,这个问题可通过合成互补链退火来部分解决.其次,在化学合成中不能保证前一步产物能100%延长到下一步的产物,随着长度的延长,产物合成率下降,而且这些非全长的序列需除去以免影响后续应用.最后,在寡核苷酸的合成中也会出现大量的错误,而且出错误率随长度增加而增加.对于较长的基因往往需要分成若干小的片段进行合成,然后经拼接才能得到完整的基因,这使得基因制备难度加大,并且费用相对比较昂贵,从而导致化学合成法的应用具有一定的局限性.


从上述可以看到,定点突变技术在蛋白质工程中具有重要应用价值.自1982年Zoller和Smith发表寡核苷酸介导的定点突变方法以来,通过不断发展和创新,定点突变技术已经成为研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具,也是实验室中改造、优化基因常用的手段,其应用领域非常广泛,在研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的活性或者动力学特性,提高蛋白的抗原性或稳定性,改造启动子或DNA作用元件,以及药物研发、基因治疗等方面都有非常重要的应用.

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